“ 理解納米材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用對于提高納米藥物的有效性和加深對生物領(lǐng)域的理解起著至關(guān)重要的作用。熒光顯微鏡是一種強(qiáng)大的光學(xué)成像技術(shù)，可以直接觀察細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境中熒光標(biāo)記納米材料的行為。然而，傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，如共聚焦顯微鏡，由于光的衍射而具有有限的光學(xué)分辨率，因此無法提供直徑小于 250 nm 的納米材料的精確細(xì)節(jié)。幸運(yùn)的是，超分辨率熒光顯微鏡的發(fā)展克服了分辨率的限制，能夠?qū){米細(xì)胞相互作用進(jìn)行更全面的研究。在此，我們總結(jié)了通過各種超分辨率顯微技術(shù)研究的納米細(xì)胞相互作用的最新進(jìn)展。”

01研究結(jié)果

超分辨率顯微鏡可大致分為兩大類：“真正的”超分辨率技術(shù)捕捉倏逝波中包含的信息并直接給出超分辨率圖像；和“功能性”超分辨率技術(shù)，使用智能實(shí)驗(yàn)技術(shù)和對被成像樣本的已知限制來重建和產(chǎn)生確定性（利用非線性熒光團(tuán)的響應(yīng)）或隨機(jī)（利用熒光團(tuán)的復(fù)雜時間行為）超分辨率圖像。超分辨率方法也可以通過三個著名的家族來識別，如圖 1 所示，包括（i)“結(jié)構(gòu)化照明”SIM (ii) “受激發(fā)射損耗”方法STED；和(iii) “單分子定位”方法，其中單個熒光分子按順序定位，并以采集亮點(diǎn)方式重建圖像。其中SIM、STED、STORM、PALM、PAINT等多種超分辨率技術(shù)已成功應(yīng)用于生物領(lǐng)域。

圖1. 超分辨率方法目錄及其用于觀察納米材料的代表性機(jī)制的說明，包括結(jié)構(gòu)化照明、受激發(fā)射損耗和單分子定位

2.1 結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）

使用共聚焦顯微鏡和 SIM 檢測 HeLa 細(xì)胞中的金屬氧化物納米粒子。他們表明，當(dāng)使用 SIM 成像時，通過共聚焦顯微鏡獲得的圖像中似乎是納米顆粒和溶酶體共定位的一些區(qū)域被證明不是真正的共定位。納米顆粒可能包含在其他膜結(jié)合結(jié)構(gòu)（例如，內(nèi)體）中（圖 2i）。在這種情況下，SIM 能夠更準(zhǔn)確地識別與溶酶體共定位的納米顆粒，這有助于納米藥物載體設(shè)計，該載體設(shè)計結(jié)合了 pH 觸發(fā)的藥物釋放，以實(shí)現(xiàn)精確的治療有效載荷遞送。

2.2 受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）

圖 3 STED 研究的納米細(xì)胞相互作用，包括納米顆粒的內(nèi)吞作用機(jī)制和內(nèi)化量化

2.3 隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）

圖4 STORM 研究的納米細(xì)胞相互作用，包括攝取機(jī)制和蛋白冠的形成

2.4 光活化定位顯微鏡（PALM）

如圖 5i 所示，納米顆粒（紅色）首先粘附在質(zhì)膜上，而網(wǎng)格蛋白（藍(lán)色）不可見。 然后，CCP 信號逐漸增強(qiáng)，表明 cla-thrin 向該站點(diǎn)募集。 在這 55 ± 23 秒的持續(xù)時間內(nèi)，納米粒子的發(fā)射強(qiáng)度基本保持不變。 CCP 信號達(dá)到峰值后，納米顆粒強(qiáng)度開始降低。 在后期（45-75 秒），在 CCP 的 PALM 圖像和納米粒子軌跡中都觀察到了 100 nm 的橫向運(yùn)動，這可能是由于納米粒子在胞內(nèi)區(qū)。 雖然這項(xiàng)工作只關(guān)注網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，但它為研究 PALM 納米顆粒的其他內(nèi)吞作用機(jī)制開辟了一條途徑。 PALM 還被用來表征和量化 10 nm 分辨率下不同剛度的 RGD 矩陣上的早期整合素簇（圖 5ii）。 結(jié)果表明，非常早期的粘連由 50 個 β3 激活的整聯(lián)蛋白的 100 nm 簇組成。 這些早期的粘連形成類似地在柔性和剛性基材上，但是大多數(shù)粘附在剛性基材上是暫時的。

過去的十年中，隨著超分辨率技術(shù)的整合，納米細(xì)胞相互作用中的光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域經(jīng)歷了復(fù)興。盡管仍然存在一些擔(dān)憂，超分辨率顯微鏡與其他熒光顯微鏡技術(shù)一樣，依賴于細(xì)胞內(nèi)熒光分子的表達(dá)，通常是通過引入可直接影響細(xì)胞生理的外部基因，因此可能無法反映“真實(shí)”的納米細(xì)胞相互作用，毫無疑問，超分辨率技術(shù)的發(fā)展代表了一項(xiàng)重大進(jìn)步，也是了解納米材料在生物領(lǐng)域之旅中的行為的有力工具。

在本研究中， 這項(xiàng)2014年諾貝爾化學(xué)獎的發(fā)現(xiàn)已在國內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現(xiàn)已發(fā)布超高分辨率顯微系統(tǒng) iSTORM ，采用3D隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)技術(shù)、高精度細(xì)胞實(shí)時鎖定技術(shù)、多通道同時成像技術(shù)等，以 納米級觀測精度 、 高穩(wěn)定性 、 廣泛環(huán)境適用 、 快速成像 、 簡易操作 等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可。

1. Advances in super-resolution fluorescence microscopy for the study of nano–cell interactions

寧波力顯智能科技有限公司（INVIEW）是專業(yè)從事超高分辨率顯微技術(shù)和產(chǎn)品研發(fā)的科技企業(yè)，依托復(fù)旦大學(xué)的自動控制、新一代信息技術(shù)及香港科技大學(xué)的生物、光學(xué)、圖像處理等的技術(shù)，擁有光學(xué)、生物、自控、機(jī)械、信息技術(shù)等多領(lǐng)域交叉學(xué)科技術(shù)團(tuán)隊(duì)，將2014年諾貝爾化學(xué)獎技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，推出了超高分辨率顯微產(chǎn)品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。