“ 單粒子追蹤（single-particle tracking，SPT）是對(duì)介質(zhì)內(nèi)單個(gè)粒子運(yùn)動(dòng)的觀察。坐標(biāo)時(shí)間序列，可以是二維（x , y）或三維（x , y , z），被稱為軌跡。通常使用統(tǒng)計(jì)方法分析軌跡，以提取有關(guān)粒子潛在動(dòng)力學(xué)的信息。這些動(dòng)力學(xué)可以揭示所觀察到的傳輸類型（例如，熱傳輸或活動(dòng)傳輸）、粒子移動(dòng)的介質(zhì)以及與其他粒子的相互作用的信息。在隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的情況下，可以使用軌跡分析來測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)。”

顯微技術(shù)允許使用光漂白后熒光恢復(fù)（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP）或單粒子或量子點(diǎn)跟蹤的單蛋白質(zhì)遷移率表征蛋白質(zhì)的全局遷移率分析。例如，全內(nèi)反射熒光顯微鏡允許擬南芥質(zhì)膜蛋白的 SPT，揭示它們的異質(zhì)分布、低橫向擴(kuò)散和響應(yīng)鹽脅迫的動(dòng)態(tài)特性。然而，基于綠色熒光蛋白的 SPT 研究受到表面蛋白質(zhì)密度的限制，因?yàn)檠苌浒l(fā)射熒光會(huì)阻止跟蹤距離小于 1 μm 的單個(gè)蛋白質(zhì)。而基于時(shí)間發(fā)射去相關(guān)的高密度 SPT 技術(shù)，例如使用光激活定位顯微鏡（single-particle tracking with photoactivated localization microscopy，sptPALM）進(jìn)行單粒子跟蹤，打破了經(jīng)典光學(xué)顯微鏡的衍射極限并達(dá)到納米級(jí)空間分辨率，使得以~20-80 nm 的精度表征質(zhì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)異質(zhì)性成為可能。在這項(xiàng)研究中，研究者報(bào)告了活細(xì)胞 sptPALM 技術(shù)在植物中的首次使用，提供了單個(gè)膜蛋白運(yùn)動(dòng)的高密度超分辨率納米級(jí)圖像。

《Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms》

01研究結(jié)果

1、超高分辨率動(dòng)態(tài)成像

首先，研究者在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)了可用于光活化的mEOS2融合蛋白，并在使用斜向照明后進(jìn)行了單蛋白追蹤。而后從眾多稀疏的mEOS2融合蛋白中構(gòu)建了超分辨率圖像，在 5 分鐘的實(shí)驗(yàn)記錄期間，在 ~900平方微米的細(xì)胞區(qū)域上檢測(cè)到了 >100,000 個(gè)單體熒光點(diǎn)。這組數(shù)據(jù)分別提供了二維空間密度圖和 mEOS2 融合蛋白與兩個(gè)質(zhì)膜標(biāo)記物 AtPIP2;1（質(zhì)膜內(nèi)在蛋白）和 LTi6a（低溫誘導(dǎo)蛋白）以及液泡膜標(biāo)記物 AtTIP1;1（液泡膜內(nèi)在蛋白）的相應(yīng)軌跡。

圖1. sptPALM 成像

AtPIP2;1-mEOS2 顯示出異質(zhì)和稀疏的定位，密度相對(duì)較低（1.12 個(gè)分子每平方微米）（圖 1A，左圖）。重建的軌跡反映了高限制行為（圖 1A，中圖和右圖）。LTi6a-mEOS2 的超分辨率圖表現(xiàn)出更均勻的分布（圖 1B，左圖），軌跡圖顯示具有更高的移動(dòng)性（圖 1B，中圖和右圖）。AtTIP1;1-mEOS2 的遷移率也被記錄下來，證明了 sptPALM 對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜蛋白的適用性。超分辨率圖像表明 AtTIP1;1-mEOS2 的移動(dòng)性非常快，導(dǎo)致均勻的重新分配（圖 1C）。

2、膜蛋白動(dòng)態(tài)軌跡特征

證實(shí)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)行為變異性很弱且可重復(fù)后，對(duì)于持續(xù)160 毫秒（≥8 幀）以上的軌跡，研究者計(jì)算了均方位移 （mean square displacement，MSD），以描述分子的擴(kuò)散特性，并通過線性回歸擬合提取瞬時(shí)擴(kuò)散系數(shù) D 。這些遷移率值的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)鐘形分布。通過正態(tài)分布擬合 D ，提取每個(gè)細(xì)胞的峰值。在表達(dá) AtPIP2;1-mEOS2 的細(xì)胞中觀察到的低 D 值表明該蛋白質(zhì)基本上是固定的。然而，在表達(dá)這種融合蛋白的一些細(xì)胞中，可以清楚地觀察到 D 值的雙鐘形分布，表明存在少量可移動(dòng)的蛋白分子。相比之下，LTi6a-mEOS2 和 AtTIP1；1-mEOS2 的擴(kuò)散行為更強(qiáng)。

圖2. 運(yùn)動(dòng)軌跡相關(guān)指標(biāo)

這些結(jié)果指向了植物膜蛋白的對(duì)比動(dòng)力學(xué)特征。運(yùn)動(dòng)性最低的 AtPIP2;1-mEOS2 的移動(dòng)性比其哺乳動(dòng)物同源物 AQP1 低7到19倍，揭示植物特有的行為；植物細(xì)胞質(zhì)膜中的脂質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)與 LTi6a 的擴(kuò)散系數(shù)處于同一數(shù)量級(jí)；最后，發(fā)現(xiàn) AtTIP1;1-mEOS2 的平面遷移率略高于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜蛋白，這代表了膜蛋白記錄的最快運(yùn)動(dòng)之一，與從桉樹細(xì)胞中純化的液泡膜中的脂質(zhì)處于同一數(shù)量級(jí)。進(jìn)一步研究表明肌動(dòng)蛋白部分與 AtPIP2;1-mEOS2 的運(yùn)動(dòng)限制有關(guān)，但主要原因是細(xì)胞壁通過內(nèi)部膨脹壓力與質(zhì)膜緊密結(jié)合，導(dǎo)致膜蛋白的橫向擴(kuò)散受阻。

02研究總結(jié)

• sptPALM 技術(shù)可在植物細(xì)胞膜蛋白中應(yīng)用；
• 不同膜蛋白分子的運(yùn)動(dòng)特征差別較大，與同源物也有較大差別；
• AtPIP2;1的運(yùn)動(dòng)限制主要來源于細(xì)胞壁。

在本研究中，研究者主要借助 sptPALM 來破譯植物活細(xì)胞中液泡膜和質(zhì)膜蛋白的動(dòng)態(tài)組織。 PALM 與STORM原理相似，STORM同樣可用于SPT，且具有更高的分辨率。這項(xiàng)2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的發(fā)現(xiàn)已在國內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現(xiàn)已發(fā)布超高分辨率顯微系統(tǒng) iSTORM ，采用3D隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)技術(shù)、高精度細(xì)胞實(shí)時(shí)鎖定技術(shù)、多通道同時(shí)成像技術(shù)等，以 納米級(jí)觀測(cè)精度 、 高穩(wěn)定性 、 廣泛環(huán)境適用 、 快速成像 、 簡(jiǎn)易操作 等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可。

參考文獻(xiàn)：

1. Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms

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