超高分辨率 顯微成像系統(tǒng)iSTORM 標(biāo)準(zhǔn)版
超高分辨率 顯微成像系統(tǒng)iSTORM 標(biāo)準(zhǔn)版
超高分辨率顯微成像系統(tǒng)iSTORM ，綜合運用了 TIRF、dSTORM、STORM、PALM等多種成像技術(shù)，得到了超高分辨率、超穩(wěn)定、超便捷的成像方法，成功實現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數(shù)、亞細(xì)胞及超分子結(jié)構(gòu)解析、生物大分子生物動力學(xué)等研究成為現(xiàn)實，給生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來重大突破。超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構(gòu)、2小時新手掌握等特點，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務(wù)與實驗方案整體解決方案，以納米級觀測精度、高穩(wěn)定性、廣泛環(huán)境適用、快速成像、簡易操作等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可。歡迎預(yù)約試拍！聯(lián)系電話0512-81868806 17788523055。
成功實現(xiàn)2014年諾貝爾化學(xué)獎-隨機光學(xué)重建STORM技術(shù)原理的產(chǎn)業(yè)化，加入柱面鏡設(shè)計，在XY軸分辨率達(dá)20nm、Z 軸分辨率達(dá) 50nm，突破衍射極限，實現(xiàn)3D成像功能。
采用專有的多通道同時成像的光路設(shè)計，提供穩(wěn)定的光路。自主開發(fā)的成像分光光路，可保證通道間的光學(xué)路徑相對獨立，使得樣品發(fā)出的熒光最大效率地被探測器接收，最大限度降低通道間的串?dāng)_。并配合以最佳染料方案和最佳成像緩沖液配方，以多通道同時成像的方式，在幾分鐘到十幾分鐘的時間范圍內(nèi)實現(xiàn) 20nm 的超高分辨率成像。
采用標(biāo)準(zhǔn)的樣品制備以及緩沖液配方protocol，解決了超高拍攝樣品難以制備的問題，經(jīng)過優(yōu)化的樣本制備方案，僅需3步即可上機檢測，“傻瓜式”操作，易學(xué)易用，新手2個小時簡單培訓(xùn)即可上機獲得理想的超高分辨率顯微成像結(jié)果。
采用納米級實時動態(tài)鎖定技術(shù)，以實時物理補償方式糾正樣品漂移，無需預(yù)熱、即開即用、操作簡便，免受如氣流、溫度變化、噪音、機械振動等環(huán)境問題對樣品位置的影響，在高樓層、嘈雜、震動、常溫常態(tài)的環(huán)境下也能穩(wěn)定成像，具有高效、簡便、對環(huán)境適應(yīng)性好的特性，非常友好易用。
細(xì)胞端粒 DNA 結(jié)構(gòu)的三維超高分辨率成像。圖 (a) 為寬場成像，顯示細(xì)胞核內(nèi)端粒 DNA 形成 foci; 圖 (b) 和 (c) 為圖 (a) 所框 foci 的 三維超高分辨率圖像，顯示寬場的一個 foci 實際包含多個小的 foci, 超高分辨率成像提供了精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，有助于對結(jié)構(gòu)變化的觀察。
小鼠腦切片神經(jīng)突觸的超高分辨率成像。圖 (a)、(c) 和 (e) 顯示寬場成像無法提供精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息；圖 (b)、(d) and (f) 是力顯智能科 技雙通道超高分辨率顯微鏡提供的超高分辨率圖像，突觸前膜和突觸后膜的結(jié)構(gòu)清晰可辨。
Hela 細(xì)胞中順式高爾基體網(wǎng)絡(luò)蛋白 GM 130 和反式高爾基體 網(wǎng)絡(luò)蛋白 Golgin 97 的雙通道超高分辨率成像。（a）寬場成像顯 示兩個蛋白局部重疊；（b）超高分辨率成像清晰顯示兩個蛋白分 別位于高爾基體的兩個層面。
酵母細(xì)胞中紡錘極體的微管蛋白 Tub1 和 Tub4 的雙通道超 高分辨率成像，兩種蛋白分布構(gòu)建了 GFP 和 RFP 的重組蛋白，再 用 GFP 納米抗體和 RFP 納米抗體分別進行免疫熒光染色。圖（a） 和圖（b) 為寬場成像，圖（c) 和圖（d）為相應(yīng)的超高分辨率成像。 圖（b) 為圖（a) 所框區(qū)域的放大，相應(yīng)的超高分辨率圖像（d) 清 晰顯示紡錘微管蛋白錨定到紡錘極體。
COS-7 細(xì)胞中線粒體的三維超高分辨率成像。線粒體外膜蛋 白 Tom20 采用間接免疫熒光標(biāo)記。外膜蛋白勾勒的線粒體呈中空 結(jié)構(gòu)，寬場成像或共聚焦顯微鏡成像難以捕捉如此清晰的結(jié)構(gòu)特 征。z 軸的位置信息用顏色梯度表示。
力顯智能科技三通道超高分辨率成像。圖 (a) 為 COS7 細(xì)胞的線粒體外膜蛋白 TOM20（紫色）、線粒體基質(zhì)蛋白 COX IV（藍(lán)色）和 高爾基體 TGN46（綠色）的超高分辨率成像。圖 (b) 為 COS7 細(xì)胞的線粒體外膜蛋白 TOM20（紅色）、核膜蛋白 lamin（藍(lán)色）和高爾 基體蛋白 TGN46（綠色）的超高分辨率成像。
“將傳統(tǒng)的能夠準(zhǔn)確標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)多種大分子的免疫組織化學(xué)染色技術(shù)與多色三維隨機光學(xué)重構(gòu)超分辨率顯微鏡（3D-dSTORM）結(jié)合，使對細(xì)胞壁多糖高靈敏度、高分辨率成像成為可能。”
| iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng) | ||
| XY 分辨率 | ~20nm由自動對焦穩(wěn)控 | |
| TIRF功能 | 完全集成，TIRF/HILO/EPI照明方式可方便調(diào)節(jié) |
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| 多通道成像 | 匹配 單/雙/三 通道同時成像 | |
| 主動式鎖定系統(tǒng) | Luna 1 nm精度漂移補償完全自動化 | |
| 圖像處理 | 多通道其他可使用染料及熒光蛋白 |
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| 軟件Serendipity |
系統(tǒng)控制：照明系統(tǒng)，主動鎖定系統(tǒng)（LUNA)，TIRF電動調(diào)節(jié)系統(tǒng) 圖像顯示：明場圖像顯示，寬場圖像顯示，超高圖像顯示 圖像采集 超高分辨圖像重構(gòu) 圖像分析處理 |
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熒光染料被激發(fā)進入發(fā)射態(tài)，之后會進入暗態(tài)（Dark state），在暗態(tài)中它們將與自由氧結(jié)合，進入漂白狀態(tài)。在漂白狀態(tài)下，染料不會再次發(fā)出熒光。如果不讓染料與自由氧結(jié)合，它將無法進入漂白狀態(tài)，一直維持在暗態(tài)。高功率的激發(fā)光可以使染料從暗態(tài)再次進入發(fā)射態(tài)。這種從亮到暗再到亮的狀態(tài)切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過隨機的分批“點亮”目標(biāo)分子來進行超分辨定位。這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團的準(zhǔn)確位置，多次重復(fù)這個過程，每次隨機打開熒光基團的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。
iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實驗室、研究所及醫(yī)院的實驗與觀察。樣品廣泛適用于分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)固定的細(xì)胞、組織、細(xì)菌、酵母和病毒的研究，iSTORM活細(xì)胞版也可以進行活細(xì)胞的相關(guān)成像。
iSTORM技術(shù)采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機染料。理論上，與激光器波長兼容的光切換染料均適用。但是，用戶應(yīng)該嚴(yán)格測試染料的光切換特性，例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數(shù)越多的染料越合適。本手冊中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對熒光染料，這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統(tǒng)的選擇。如果實驗僅需要觀察一個目標(biāo)（即單通道），Alexa Fluorò 647是首選，因為相比Alexa Fluorò 750，Alexa Fluorò 647 每個切換周期釋放出更多的光子，且具有更短的工作周期。
此外，諸如藍(lán)色吸收染料（Atto 488、Alexa 488、Atto 520）、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料（Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto 680）和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來超高成像。
對生物結(jié)構(gòu)進行特異性標(biāo)記可通過免疫染色（直接免疫染色法或間接免疫染色法）且以光切換染料標(biāo)記，也可以通過多肽或酶體（例如商業(yè)化產(chǎn)品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等）標(biāo)記目標(biāo)蛋白。
適用于iSTORM系統(tǒng)的二抗已經(jīng)商業(yè)化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對一抗、FAB片段或者納米抗體進行熒光標(biāo)記，由于熒光分子距離目標(biāo)蛋白更近，所以蛋白定位相比間接免疫熒光標(biāo)記法更加準(zhǔn)確。
由于力顯智能科技的iSTORM產(chǎn)品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時成像、界面友好、簡單易用、系統(tǒng)穩(wěn)定性好、環(huán)境適應(yīng)性高等綜合特點和優(yōu)勢，使得它能夠幫助到更多科學(xué)家進行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學(xué)研究，已為包括香港科技大學(xué)、香港大學(xué)、中山大學(xué)、深圳大學(xué)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院等在內(nèi)等超過50家科研小組和100位科研人員的科學(xué)研究的提供幫助，并獲得了高度認(rèn)可。
樣品最好是染色完成后,及時進行拍照，樣本來不及拍照可以避光保存在4℃，保存時間不超過3天。
正常情況下，以雙通道為例，曝光時間30ms, 一邊拍以便進行實時重構(gòu)，拍攝10000幀需要8--10min左右。如果先拍照后分析，曝光時間10ms為例，拍攝10000幀需要1min40s左右。
針對固定的細(xì)胞我們有專用的雙通道和三通道成像緩沖液試劑盒，進行單獨售賣。
可以先用寬場成像，對樣品整體進行快速掃描，找到目標(biāo)細(xì)胞后進行超高成像。
使用配置中的緩沖液和染料及照明光配合，可以使樣品上標(biāo)記的熒光染料“閃爍”，使得原始圖像上可以獲得單分子的熒光染料圖像，之后通過單分子定位原理，對每個亮點進行位置擬合，并記錄在超高成像結(jié)果中。單個熒光點的定位精度與拍攝中獲得的熒光點光子數(shù)目有關(guān)系，一般情況下可以將分辨率提升10倍。
根據(jù)樣品及結(jié)構(gòu)的不同，成像時間也不同。結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的固定細(xì)胞可能要幾分鐘到十幾分鐘，活細(xì)胞成像最快可以幾秒鐘完成。
使用物理鎖定的方式，實時追蹤樣品上的一個基準(zhǔn)點的位置，并根據(jù)此移動樣品位置，補償樣品漂移。因為基準(zhǔn)點可以在樣品制備之前加入，并且在成像過程中亮度保持穩(wěn)定，所以不會增加樣品制備的復(fù)雜性，可以在整個成像過程中保持樣品位置穩(wěn)定在1nm左右。
技術(shù)無法對比，需要根據(jù)具體應(yīng)用場景具體分析，STORM空間分辨率高，SIM時間分辨率高。
具體損傷不好量化，但iSTORM可以進行活細(xì)胞成像.
抗體 病毒 核糖體。
扁平細(xì)胞更適合，但是不絕對，厚的細(xì)胞或者組織切片也可以拍超高。
（1）照明鎖定系統(tǒng)的照明部分：使用功率1w，波長455nm的科勒照明系統(tǒng)，明場照明波段與熒光照明波長和成像波段不重合；
（2）照明鎖定系統(tǒng)的玻片部分：使用融化在玻片上的塑料小球，保證和樣品之間沒有相對移動；
（3）照明鎖定系統(tǒng)的鎖定部分：采用PI壓電陶瓷平臺，精度1nm，位移范圍200um，實現(xiàn)精確校正樣本漂移量。
iSTORM超高TIRF系統(tǒng)是將波長為561nm、647nm、750nm的激光光纖接入TIRF模塊，通過步進電機驅(qū)動器調(diào)節(jié)激光位置，實現(xiàn)激光照明光路Epi、HILO和Tir三種照明，在Tir處精調(diào)驅(qū)動器找到最佳成像位置。
所使用相機主要參數(shù)：sCMOS四百萬像素，2048x2048，pixel6.5um，成像有效面積13.3x13.3mm，幀率30fps，極限幀率100fps（搭配PCIe），量子效率82%@560nm。
水平方向20nm，垂直（z）方向50nm，三通道每個區(qū)域像素：738x345，每個通道視野范圍：48x22um，垂直（z）方向成像范圍1000nm。
力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡可實現(xiàn)3通道同時成像，分別是561、656、750三個通道，每通道激光照明功率不低于150mW，可實現(xiàn)0~100%調(diào)節(jié)。
力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡系統(tǒng)包含以下模塊：顯微鏡主體、三色成像系統(tǒng)、TIRF系統(tǒng)、激光和控制器系統(tǒng)、成像工作站。
可以的，可以使用商用顯微鏡的鎖焦系統(tǒng)，z方向鎖焦精度在20-50nm；使用力顯三維鎖定系統(tǒng)，z方向鎖定精度可以達(dá)到5nm。
算法經(jīng)過優(yōu)化后，iSTORM超高圖像可以實現(xiàn)實時重構(gòu)，立等可得。
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