“ 單粒子追蹤（single-particle tracking，SPT）是對介質(zhì)內(nèi)單個粒子運動的觀察。坐標時間序列，可以是二維（x , y）或三維（x , y , z），被稱為軌跡。通常使用統(tǒng)計方法分析軌跡，以提取有關粒子潛在動力學的信息。這些動力學可以揭示所觀察到的傳輸類型（例如，熱傳輸或活動傳輸）、粒子移動的介質(zhì)以及與其他粒子的相互作用的信息。在隨機運動的情況下，可以使用軌跡分析來測量擴散系數(shù)。”

顯微技術允許使用光漂白后熒光恢復（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP）或單粒子或量子點跟蹤的單蛋白質(zhì)遷移率表征蛋白質(zhì)的全局遷移率分析。例如，全內(nèi)反射熒光顯微鏡允許擬南芥質(zhì)膜蛋白的 SPT，揭示它們的異質(zhì)分布、低橫向擴散和響應鹽脅迫的動態(tài)特性。然而，基于綠色熒光蛋白的 SPT 研究受到表面蛋白質(zhì)密度的限制，因為衍射發(fā)射熒光會阻止跟蹤距離小于 1 μm 的單個蛋白質(zhì)。而基于時間發(fā)射去相關的高密度 SPT 技術，例如使用光激活定位顯微鏡（single-particle tracking with photoactivated localization microscopy，sptPALM）進行單粒子跟蹤，打破了經(jīng)典光學顯微鏡的衍射極限并達到納米級空間分辨率，使得以~20-80 nm 的精度表征質(zhì)膜蛋白的結構和動態(tài)異質(zhì)性成為可能。在這項研究中，研究者報告了活細胞 sptPALM 技術在植物中的首次使用，提供了單個膜蛋白運動的高密度超分辨率納米級圖像。

《Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms》

01研究結果

1、超高分辨率動態(tài)成像

首先，研究者在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達了可用于光活化的mEOS2融合蛋白，并在使用斜向照明后進行了單蛋白追蹤。而后從眾多稀疏的mEOS2融合蛋白中構建了超分辨率圖像，在 5 分鐘的實驗記錄期間，在 ~900平方微米的細胞區(qū)域上檢測到了 >100,000 個單體熒光點。這組數(shù)據(jù)分別提供了二維空間密度圖和 mEOS2 融合蛋白與兩個質(zhì)膜標記物 AtPIP2;1（質(zhì)膜內(nèi)在蛋白）和 LTi6a（低溫誘導蛋白）以及液泡膜標記物 AtTIP1;1（液泡膜內(nèi)在蛋白）的相應軌跡。

圖1. sptPALM 成像

AtPIP2;1-mEOS2 顯示出異質(zhì)和稀疏的定位，密度相對較低（1.12 個分子每平方微米）（圖 1A，左圖）。重建的軌跡反映了高限制行為（圖 1A，中圖和右圖）。LTi6a-mEOS2 的超分辨率圖表現(xiàn)出更均勻的分布（圖 1B，左圖），軌跡圖顯示具有更高的移動性（圖 1B，中圖和右圖）。AtTIP1;1-mEOS2 的遷移率也被記錄下來，證明了 sptPALM 對細胞內(nèi)膜蛋白的適用性。超分辨率圖像表明 AtTIP1;1-mEOS2 的移動性非?？?，導致均勻的重新分配（圖 1C）。

2、膜蛋白動態(tài)軌跡特征

證實細胞間運動行為變異性很弱且可重復后，對于持續(xù)160 毫秒（≥8 幀）以上的軌跡，研究者計算了均方位移 （mean square displacement，MSD），以描述分子的擴散特性，并通過線性回歸擬合提取瞬時擴散系數(shù) D 。這些遷移率值的對數(shù)呈現(xiàn)鐘形分布。通過正態(tài)分布擬合 D ，提取每個細胞的峰值。在表達 AtPIP2;1-mEOS2 的細胞中觀察到的低 D 值表明該蛋白質(zhì)基本上是固定的。然而，在表達這種融合蛋白的一些細胞中，可以清楚地觀察到 D 值的雙鐘形分布，表明存在少量可移動的蛋白分子。相比之下，LTi6a-mEOS2 和 AtTIP1；1-mEOS2 的擴散行為更強。

圖2. 運動軌跡相關指標

這些結果指向了植物膜蛋白的對比動力學特征。運動性最低的 AtPIP2;1-mEOS2 的移動性比其哺乳動物同源物 AQP1 低7到19倍，揭示植物特有的行為；植物細胞質(zhì)膜中的脂質(zhì)的擴散系數(shù)與 LTi6a 的擴散系數(shù)處于同一數(shù)量級；最后，發(fā)現(xiàn) AtTIP1;1-mEOS2 的平面遷移率略高于哺乳動物細胞膜蛋白，這代表了膜蛋白記錄的最快運動之一，與從桉樹細胞中純化的液泡膜中的脂質(zhì)處于同一數(shù)量級。進一步研究表明肌動蛋白部分與 AtPIP2;1-mEOS2 的運動限制有關，但主要原因是細胞壁通過內(nèi)部膨脹壓力與質(zhì)膜緊密結合，導致膜蛋白的橫向擴散受阻。

02研究總結

• sptPALM 技術可在植物細胞膜蛋白中應用；
• 不同膜蛋白分子的運動特征差別較大，與同源物也有較大差別；
• AtPIP2;1的運動限制主要來源于細胞壁。

在本研究中，研究者主要借助 sptPALM 來破譯植物活細胞中液泡膜和質(zhì)膜蛋白的動態(tài)組織。 PALM 與STORM原理相似，STORM同樣可用于SPT，且具有更高的分辨率。這項2014年諾貝爾化學獎的發(fā)現(xiàn)已在國內(nèi)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現(xiàn)已發(fā)布超高分辨率顯微系統(tǒng) iSTORM ，采用3D隨機光學重構技術、高精度細胞實時鎖定技術、多通道同時成像技術等，以 納米級觀測精度 、 高穩(wěn)定性 、 廣泛環(huán)境適用 、 快速成像 、 簡易操作 等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。

參考文獻：

1. Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms

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