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熒光染料被激發(fā)進(jìn)入發(fā)射態(tài)，之后會(huì)進(jìn)入暗態(tài)（Dark state），在暗態(tài)中它們將與自由氧結(jié)合，進(jìn)入漂白狀態(tài)。在漂白狀態(tài)下，染料不會(huì)再次發(fā)出熒光。如果不讓染料與自由氧結(jié)合，它將無(wú)法進(jìn)入漂白狀態(tài)，一直維持在暗態(tài)。高功率的激發(fā)光可以使染料從暗態(tài)再次進(jìn)入發(fā)射態(tài)。這種從亮到暗再到亮的狀態(tài)切換看起來(lái)就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過(guò)隨機(jī)的分批“點(diǎn)亮”目標(biāo)分子來(lái)進(jìn)行超分辨定位。這樣每個(gè)活躍的熒光集團(tuán)都被分辨，它們的圖像與其他分子分開(kāi)，不重疊。這樣確定了基團(tuán)的準(zhǔn)確位置，多次重復(fù)這個(gè)過(guò)程，每次隨機(jī)打開(kāi)熒光基團(tuán)的不同亞基，得到圖像，確定每個(gè)亞基的位置后，把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。

iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實(shí)驗(yàn)室、研究所及醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)與觀察。樣品廣泛適用于分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)固定的細(xì)胞、組織、細(xì)菌、酵母和病毒的研究，iSTORM活細(xì)胞版也可以進(jìn)行活細(xì)胞的相關(guān)成像。

iSTORM技術(shù)采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機(jī)染料。理論上，與激光器波長(zhǎng)兼容的光切換染料均適用。但是，用戶應(yīng)該嚴(yán)格測(cè)試染料的光切換特性，例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個(gè)周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數(shù)越多的染料越合適。本手冊(cè)中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對(duì)熒光染料，這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統(tǒng)的選擇。如果實(shí)驗(yàn)僅需要觀察一個(gè)目標(biāo)（即單通道），Alexa Fluorò 647是首選，因?yàn)橄啾?span>Alexa Fluorò 750，Alexa Fluorò 647 每個(gè)切換周期釋放出更多的光子，且具有更短的工作周期。

此外，諸如藍(lán)色吸收染料（Atto 488、Alexa 488、Atto 520）、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料（Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto 680）和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來(lái)超高成像。

對(duì)生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性標(biāo)記可通過(guò)免疫染色（直接免疫染色法或間接免疫染色法）且以光切換染料標(biāo)記，也可以通過(guò)多肽或酶體（例如商業(yè)化產(chǎn)品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等）標(biāo)記目標(biāo)蛋白。

適用于iSTORM系統(tǒng)的二抗已經(jīng)商業(yè)化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對(duì)一抗、FAB片段或者納米抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，由于熒光分子距離目標(biāo)蛋白更近，所以蛋白定位相比間接免疫熒光標(biāo)記法更加準(zhǔn)確。

由于力顯智能科技的iSTORM產(chǎn)品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時(shí)成像、界面友好、簡(jiǎn)單易用、系統(tǒng)穩(wěn)定性好、環(huán)境適應(yīng)性高等綜合特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，使得它能夠幫助到更多科學(xué)家進(jìn)行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學(xué)研究，已為包括香港科技大學(xué)、香港大學(xué)、中山大學(xué)、深圳大學(xué)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院等在內(nèi)等超過(guò)50家科研小組和100位科研人員的科學(xué)研究的提供幫助，并獲得了高度認(rèn)可。

樣品最好是染色完成后,及時(shí)進(jìn)行拍照，樣本來(lái)不及拍照可以避光保存在4℃，保存時(shí)間不超過(guò)3天。

正常情況下，以雙通道為例，曝光時(shí)間30ms, 一邊拍以便進(jìn)行實(shí)時(shí)重構(gòu)，拍攝10000幀需要8--10min左右。如果先拍照后分析，曝光時(shí)間10ms為例，拍攝10000幀需要1min40s左右。

針對(duì)固定的細(xì)胞我們有專用的雙通道和三通道成像緩沖液試劑盒，進(jìn)行單獨(dú)售賣。

可以先用寬場(chǎng)成像，對(duì)樣品整體進(jìn)行快速掃描，找到目標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)行超高成像。

使用配置中的緩沖液和染料及照明光配合，可以使樣品上標(biāo)記的熒光染料“閃爍”，使得原始圖像上可以獲得單分子的熒光染料圖像，之后通過(guò)單分子定位原理，對(duì)每個(gè)亮點(diǎn)進(jìn)行位置擬合，并記錄在超高成像結(jié)果中。單個(gè)熒光點(diǎn)的定位精度與拍攝中獲得的熒光點(diǎn)光子數(shù)目有關(guān)系，一般情況下可以將分辨率提升10倍。

根據(jù)樣品及結(jié)構(gòu)的不同，成像時(shí)間也不同。結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的固定細(xì)胞可能要幾分鐘到十幾分鐘，活細(xì)胞成像最快可以幾秒鐘完成。

使用物理鎖定的方式，實(shí)時(shí)追蹤樣品上的一個(gè)基準(zhǔn)點(diǎn)的位置，并根據(jù)此移動(dòng)樣品位置，補(bǔ)償樣品漂移。因?yàn)榛鶞?zhǔn)點(diǎn)可以在樣品制備之前加入，并且在成像過(guò)程中亮度保持穩(wěn)定，所以不會(huì)增加樣品制備的復(fù)雜性，可以在整個(gè)成像過(guò)程中保持樣品位置穩(wěn)定在1nm左右。

技術(shù)無(wú)法對(duì)比，需要根據(jù)具體應(yīng)用場(chǎng)景具體分析，STORM空間分辨率高，SIM時(shí)間分辨率高。

具體損傷不好量化，但iSTORM可以進(jìn)行活細(xì)胞成像.

抗體 病毒 核糖體。

扁平細(xì)胞更適合，但是不絕對(duì)，厚的細(xì)胞或者組織切片也可以拍超高。

（1）照明鎖定系統(tǒng)的照明部分：使用功率1w，波長(zhǎng)455nm的科勒照明系統(tǒng)，明場(chǎng)照明波段與熒光照明波長(zhǎng)和成像波段不重合；

（2）照明鎖定系統(tǒng)的玻片部分：使用融化在玻片上的塑料小球，保證和樣品之間沒(méi)有相對(duì)移動(dòng)；

（3）照明鎖定系統(tǒng)的鎖定部分：采用PI壓電陶瓷平臺(tái)，精度1nm，位移范圍200um，實(shí)現(xiàn)精確校正樣本漂移量。

iSTORM超高TIRF系統(tǒng)是將波長(zhǎng)為561nm、647nm、750nm的激光光纖接入TIRF模塊，通過(guò)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器調(diào)節(jié)激光位置，實(shí)現(xiàn)激光照明光路Epi、HILO和Tir三種照明，在Tir處精調(diào)驅(qū)動(dòng)器找到最佳成像位置。

所使用相機(jī)主要參數(shù)：sCMOS四百萬(wàn)像素，2048x2048，pixel6.5um，成像有效面積13.3x13.3mm，幀率30fps，極限幀率100fps（搭配PCIe），量子效率82%@560nm。

水平方向20nm，垂直（z）方向50nm，三通道每個(gè)區(qū)域像素：738x345，每個(gè)通道視野范圍：48x22um，垂直（z）方向成像范圍1000nm。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡可實(shí)現(xiàn)3通道同時(shí)成像，分別是561、656、750三個(gè)通道，每通道激光照明功率不低于150mW，可實(shí)現(xiàn)0~100%調(diào)節(jié)。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡系統(tǒng)包含以下模塊：顯微鏡主體、三色成像系統(tǒng)、TIRF系統(tǒng)、激光和控制器系統(tǒng)、成像工作站。

可以的，可以使用商用顯微鏡的鎖焦系統(tǒng)，z方向鎖焦精度在20-50nm；使用力顯三維鎖定系統(tǒng)，z方向鎖定精度可以達(dá)到5nm。

算法經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，iSTORM超高圖像可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)重構(gòu)，立等可得。