隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，簡稱STORM)茅主，是一種超分辨率顯微鏡，其分辨率比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上奕辖。
我們知道获讳，光學顯微鏡憑借其非接觸风钻、無損傷等優(yōu)點，長期以來是生物醫(yī)學研究的重要工具挽放。但由于光的衍射限制了光學顯微鏡的分辨率狠寒，傳統(tǒng)的顯微鏡已經(jīng)不適于生命科學研究中的超微結(jié)構(gòu)成像了。本文將從原理质脐、應用等方面對隨機光學重建顯微鏡STORM進行相關(guān)研究伐狼，歡迎各位老師討論交流。
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光的衍射
限制了光學顯微鏡的分辨率
在了解STORM之前嗜谎，需要先知悉一個概念岁十。眾所周知，光學顯微鏡是用可見光來觀察生物樣品的早知。而光是一種橫波惦踩，當它經(jīng)過一個圓孔，且這個圓孔的大小與光的波長差別不大時杖扫，光在此時不會沿直線傳播押强，而是在各個方向上“溜走”。光在傳播過程中煎喘，遇到障礙物或小孔時溜棉，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象，這就叫光的衍射卫漫。
由此而形成的圓孔衍射圖樣菲饼，叫“艾里斑”（圖1）。正因如此列赎，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無法把光線在像平面匯聚成無限小的點宏悦，而是只能形成有限大小的艾里斑。如果兩個點很接近包吝，像平面上的兩個艾里斑就幾乎重合在一起饼煞，那物平面上的兩個點就不可分辨了。
圖1、“艾里斑”概念圖
所以砖瞧，光的衍射使得光學顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)息堂，使得傳統(tǒng)顯微鏡無法清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu),極大制約了生命科學研究的發(fā)展。
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超分辨率顯微鏡
打破分辨率極限
科研工作者為了看到更精細的生命體精細結(jié)構(gòu)块促，就要想辦法突破這一成像障礙荣堰。為此，多種超分辨率顯微鏡被開發(fā)了出來（超越了光學顯微鏡的分辨率極限竭翠，故被稱為超分辨顯微鏡）振坚。在這里，我們集中討論其中這樣一個具有相對優(yōu)勢的顯微鏡：隨機光學重建顯微鏡STORM祠劣。
在2006年的Nature上秤淀，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉(zhuǎn)化的發(fā)光分子團，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)条焙，并將其命名為隨機光學重建顯微鏡阅六，簡稱STORM。
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隨機光學重建顯微鏡STORM
技術(shù)原理簡介
正如前面提到的那樣漂熙，兩個挨得很近的光點會讓我們分辨不出誰是誰芒单，那么如果我們分開來看呢？
也就是說袖况，當我們照射并觀察第一個點時抗躺，第二個點并不會發(fā)光，自然不會產(chǎn)生艾里斑影響我們觀察第一個點抢驴，前者艾里斑的中心點位置就是熒光分子的準確位置蛀篓。接下來，通過某種方法做身，讓第二個點被照亮丸爵。這個時候第一個點又不在光斑的照明范圍之內(nèi)了，同樣不會干擾對第二個點的觀察汁咏。通過這種“以時間換空間”的設計亚斋，巧妙地繞開了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛，將光學顯微鏡的分辨率大大提高攘滩。
STORM技術(shù)就運用了這種思想帅刊，它使用的是有機熒光分子對染料，并且通過一些方法使細胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光漂问，而不是全部赖瞒。這樣由于發(fā)光的點分布比較分散，重疊比較少蚤假，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子栏饮。在一次激發(fā)中吧兔，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發(fā)中袍嬉，可以確定另外一部分光暈的中心掩驱，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加，就是完整而清晰的圖像冬竟。
STROM成像過程包含一系列圖像循環(huán)。每個循環(huán)中鼻昼，只打開視野下一部分熒光基團悟津，這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開吸坐，不重疊宗瓢。這樣確定了基團的準確位置，多次重復這個過程痢抹，每次隨機打開熒光基團的不同亞基旷厨，得到圖像，確定每個亞基的位置后院籍，把以上圖像重建成清晰的整個圖像腋意。理論上STORM可得到分辨率達到幾個納米的熒光圖像。
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隨機光學重建顯微鏡STORM
技術(shù)應用案例
隨機光學重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術(shù)衡达，能夠在二維或三維往软、多種顏色下成像，甚至可以對活細胞成像郎抖。這種成像技術(shù)的方法根據(jù)正在成像的內(nèi)容哟蝉、如何成像以及正在產(chǎn)生的圖像類型而變化很大，可以應用于生命科學的許多領域茫舶，并為從神經(jīng)科學到亞細胞科學的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像械巡。自STORM技術(shù)被提起以來，越來越多的研究人員認識到了這項技術(shù)的優(yōu)勢并廣泛運用于研究中饶氏。
（以近些年的部分研究成果為例）
2013年讥耗，cell 雜志上的一篇研究報告：莊小威團隊利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對端粒 DNA 進行原位成像，直接可視化染色質(zhì)中的 T 環(huán)結(jié)構(gòu)嚷往，并系統(tǒng)地評估保護蛋白在 T 環(huán)形成中的作用葛账。（點此查看原文）
圖3、STORM 成像顯示染色質(zhì)擴散后的 T 環(huán)
2017年皮仁，Liu Riyue團隊開發(fā)了一種光漂白的方法籍琳，以有效地降低藍藻和植物細胞的自身熒光并利用STORM技術(shù)在球形藍藻原綠球菌和開花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率。（點此查看原文）
圖4贷祈、雙Z環(huán)的STORM圖像
2018年趋急，Lin, Danying團隊提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法，擴展了多層 3D STORM的成像深度，并顯示了COS-7 細胞中微管呜达、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道姚垂、擴展深度 3D prSTORM圖像。（點此查看原文）
圖5槽脑、 COS-7 細胞中微管障氛、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴展深度 3D prSTORM 圖像
2019煌摊，Schlegel J , Peters S , Doose S 團隊通過直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）進行超分辨率顯微鏡觀察衫沽，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集，突出了其對細菌侵襲的重要意義资杆。（點此查看原文）
圖6酒吠、表達GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像
2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)课陪，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部唇佳，IFT亞基位于九個不同的位點，在它們進入纖毛干之前贱钩，IFT蛋白以高親和力透伺眩靠在纖毛基部的9個位點。（點此查看原文）
色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像
2021琼牧，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)恢筝，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部，IFT亞基位于九個不同的位點巨坊，在它們進入纖毛干之前撬槽，IFT蛋白以高親和力停靠在纖毛基部的9個位點趾撵。（點此查看原文）
圖7侄柔、IFT顆粒蛋白的定位，N-或C-末端3HA標記的IFT蛋白占调、KIN1/KIF3A驅(qū)動蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側(cè)（側(cè)）視圖的STORM圖像暂题。
2021，Blandin, Anne-Florence團隊利用球狀體膠質(zhì)瘤細胞擴散的體外模型究珊，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細胞比表達α5的細胞對TKIs更敏感薪者。（點此查看原文）
圖8、吉非替尼處理的細胞的雙色dSTORM圖像顯示細胞外周和核內(nèi)體上的EGFR/β1整合素復合體
STORM因為其優(yōu)異的單分子成像能力剿涮，越來越多的被用在細胞精細結(jié)構(gòu)的探索言津。對STORM的更多研究將提供更有效的方法來制備樣品和成像樣品，以及提供更高分辨率的圖像取试。相信在未來這項技術(shù)能得到進一步發(fā)展署氏，變成功能更為強大的利器腋殃。
