隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy办绝，簡(jiǎn)稱STORM)，是一種超分辨率顯微鏡，其分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上掺胖。

我們知道揽仔，光學(xué)顯微鏡憑借其非接觸、無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)焙厂，長(zhǎng)期以來(lái)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具让多。但由于光的衍射限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率，傳統(tǒng)的顯微鏡已經(jīng)不適于生命科學(xué)研究中的超微結(jié)構(gòu)成像了扫钝。本文將從原理顶食、應(yīng)用等方面對(duì)隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM進(jìn)行相關(guān)研究，歡迎各位老師討論交流刁祸。

01

—

光的衍射

限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率

在了解STORM之前熄阻，需要先知悉一個(gè)概念。眾所周知倔约，光學(xué)顯微鏡是用可見(jiàn)光來(lái)觀察生物樣品的秃殉。而光是一種橫波，當(dāng)它經(jīng)過(guò)一個(gè)圓孔浸剩，且這個(gè)圓孔的大小與光的波長(zhǎng)差別不大時(shí)钾军，光在此時(shí)不會(huì)沿直線傳播，而是在各個(gè)方向上“溜走”绢要。光在傳播過(guò)程中吏恭，遇到障礙物或小孔時(shí)，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象重罪，這就叫光的衍射樱哼。

由此而形成的圓孔衍射圖樣，叫“艾里斑”（圖1）蛆封。正因如此唇礁，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無(wú)法把光線在像平面匯聚成無(wú)限小的點(diǎn)，而是只能形成有限大小的艾里斑。如果兩個(gè)點(diǎn)很接近盏筐，像平面上的兩個(gè)艾里斑就幾乎重合在一起幌侧，那物平面上的兩個(gè)點(diǎn)就不可分辨了。

圖1规学、“艾里斑”概念圖

所以整栏，光的衍射使得光學(xué)顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)，使得傳統(tǒng)顯微鏡無(wú)法清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu),極大制約了生命科學(xué)研究的發(fā)展橡周。

02

—

超分辨率顯微鏡

打破分辨率極限

科研工作者為了看到更精細(xì)的生命體精細(xì)結(jié)構(gòu)碗昭，就要想辦法突破這一成像障礙。為此膊向，多種超分辨率顯微鏡被開(kāi)發(fā)了出來(lái)（超越了光學(xué)顯微鏡的分辨率極限体笨，故被稱為超分辨顯微鏡）。在這里糙娃，我們集中討論其中這樣一個(gè)具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的顯微鏡：隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM烧啊。

在2006年的Nature上，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復(fù)在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉(zhuǎn)化的發(fā)光分子團(tuán)憎抡，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)端杂，并將其命名為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡，簡(jiǎn)稱STORM性湿。

03

—

隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM

技術(shù)原理簡(jiǎn)介

正如前面提到的那樣纬傲，兩個(gè)挨得很近的光點(diǎn)會(huì)讓我們分辨不出誰(shuí)是誰(shuí)，那么如果我們分開(kāi)來(lái)看呢肤频？

也就是說(shuō)叹括，當(dāng)我們照射并觀察第一個(gè)點(diǎn)時(shí)，第二個(gè)點(diǎn)并不會(huì)發(fā)光着裹，自然不會(huì)產(chǎn)生艾里斑影響我們觀察第一個(gè)點(diǎn)领猾，前者艾里斑的中心點(diǎn)位置就是熒光分子的準(zhǔn)確位置。接下來(lái)骇扇，通過(guò)某種方法，讓第二個(gè)點(diǎn)被照亮面粮。這個(gè)時(shí)候第一個(gè)點(diǎn)又不在光斑的照明范圍之內(nèi)了少孝，同樣不會(huì)干擾對(duì)第二個(gè)點(diǎn)的觀察。通過(guò)這種“以時(shí)間換空間”的設(shè)計(jì)熬苍，巧妙地繞開(kāi)了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛稍走，將光學(xué)顯微鏡的分辨率大大提高。

STORM技術(shù)就運(yùn)用了這種思想柴底，它使用的是有機(jī)熒光分子對(duì)染料现辰，并且通過(guò)一些方法使細(xì)胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點(diǎn)分布比較分散托捆，重疊比較少篱汤，因此每個(gè)光暈可以近似為一個(gè)熒光分子。在一次激發(fā)中媒卑，可以確定一部分光暈的中心铃越，在下一次激發(fā)中，可以確定另外一部分光暈的中心经馍，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加切锈，就是完整而清晰的圖像。

STROM成像過(guò)程包含一系列圖像循環(huán)父绿。每個(gè)循環(huán)中尿旅，只打開(kāi)視野下一部分熒光基團(tuán)，這樣每個(gè)活躍的熒光集團(tuán)都被分辨畅廷，它們的圖像與其他分子分開(kāi)捕阅，不重疊。這樣確定了基團(tuán)的準(zhǔn)確位置狠持，多次重復(fù)這個(gè)過(guò)程疟位，每次隨機(jī)打開(kāi)熒光基團(tuán)的不同亞基，得到圖像喘垂，確定每個(gè)亞基的位置后甜刻，把以上圖像重建成清晰的整個(gè)圖像。理論上STORM可得到分辨率達(dá)到幾個(gè)納米的熒光圖像正勒。

04

—

隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM

技術(shù)應(yīng)用案例

隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術(shù)得院，能夠在二維或三維、多種顏色下成像章贞，甚至可以對(duì)活細(xì)胞成像祥绞。這種成像技術(shù)的方法根據(jù)正在成像的內(nèi)容、如何成像以及正在產(chǎn)生的圖像類型而變化很大鸭限，可以應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域蜕径，并為從神經(jīng)科學(xué)到亞細(xì)胞科學(xué)的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像。自STORM技術(shù)被提起以來(lái)败京，越來(lái)越多的研究人員認(rèn)識(shí)到了這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)并廣泛運(yùn)用于研究中兜喻。

（以近些年的部分研究成果為例）

2013年，cell 雜志上的一篇研究報(bào)告：莊小威團(tuán)隊(duì)利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對(duì)端粒 DNA 進(jìn)行原位成像冒侧，直接可視化染色質(zhì)中的 T 環(huán)結(jié)構(gòu)硫缓，并系統(tǒng)地評(píng)估保護(hù)蛋白在 T 環(huán)形成中的作用。（點(diǎn)此查看原文）

圖3阿赞、STORM 成像顯示染色質(zhì)擴(kuò)散后的 T 環(huán)

2017年恭隧，Liu Riyue團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種光漂白的方法祈哆，以有效地降低藍(lán)藻和植物細(xì)胞的自身熒光并利用STORM技術(shù)在球形藍(lán)藻原綠球菌和開(kāi)花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率。（點(diǎn)此查看原文）

圖4啃极、雙Z環(huán)的STORM圖像

2018年帆速，Lin, Danying團(tuán)隊(duì)提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法，擴(kuò)展了多層 3D STORM的成像深度苗圃，并顯示了COS-7 細(xì)胞中微管谣泄、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴(kuò)展深度 3D prSTORM圖像惫饲。（點(diǎn)此查看原文）

圖5褂圣、 COS-7 細(xì)胞中微管、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道裤础、擴(kuò)展深度 3D prSTORM 圖像

2019懊悯，Schlegel J ,  Peters S ,  Doose S 團(tuán)隊(duì)通過(guò)直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）進(jìn)行超分辨率顯微鏡觀察，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集梦皮，突出了其對(duì)細(xì)菌侵襲的重要意義炭分。（點(diǎn)此查看原文）

圖6、表達(dá)GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021剑肯，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團(tuán)隊(duì)運(yùn)用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)捧毛，表達(dá)IFT融合蛋白的細(xì)胞在纖毛基部，IFT亞基位于九個(gè)不同的位點(diǎn)让网，在它們進(jìn)入纖毛干之前呀忧，IFT蛋白以高親和力停靠在纖毛基部的9個(gè)位點(diǎn)溃睹。（點(diǎn)此查看原文）

色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021而账，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團(tuán)隊(duì)運(yùn)用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IFT融合蛋白的細(xì)胞在纖毛基部因篇，IFT亞基位于九個(gè)不同的位點(diǎn)泞辐，在它們進(jìn)入纖毛干之前，IFT蛋白以高親和力途鹤遥靠在纖毛基部的9個(gè)位點(diǎn)咐吼。（點(diǎn)此查看原文）

圖7、IFT顆粒蛋白的定位瞧佃，N-或C-末端3HA標(biāo)記的IFT蛋白赦锰、KIN1/KIF3A驅(qū)動(dòng)蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側(cè)（側(cè)）視圖的STORM圖像。

2021演茂，Blandin, Anne-Florence團(tuán)隊(duì)利用球狀體膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散的體外模型，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細(xì)胞比表達(dá)α5的細(xì)胞對(duì)TKIs更敏感沿硕。（點(diǎn)此查看原文）

圖8件银、吉非替尼處理的細(xì)胞的雙色dSTORM圖像顯示細(xì)胞外周和核內(nèi)體上的EGFR/β1整合素復(fù)合體

STORM因?yàn)槠鋬?yōu)異的單分子成像能力肤轿，越來(lái)越多的被用在細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的探索。對(duì)STORM的更多研究將提供更有效的方法來(lái)制備樣品和成像樣品郊片，以及提供更高分辨率的圖像度籍。相信在未來(lái)這項(xiàng)技術(shù)能得到進(jìn)一步發(fā)展，變成功能更為強(qiáng)大的利器焚惰。