“ 哺乳動(dòng)物的大腦由功能多樣化的突觸類型組成，將不同的神經(jīng)元群體連接成網(wǎng)絡(luò)猪叙，使復(fù)雜的行為和對(duì)外部和內(nèi)部線索的反應(yīng)成為可能恨樟。理解這種多樣性將是定義大腦連接的基礎(chǔ)。突觸是一種特殊的神經(jīng)元細(xì)胞-細(xì)胞接觸并淋，在整個(gè)神經(jīng)元群中丁傲，不同突觸的分子組成不同逞迟，以實(shí)現(xiàn)異質(zhì)連接模式和功能這些分子成分指導(dǎo)突觸發(fā)生歹对、成熟和分化在發(fā)育和成年售碳，突觸的分子多樣性進(jìn)一步受到神經(jīng)元活動(dòng)和可塑性變化等過(guò)程以及分泌因子的控制。除了突觸前和突觸后的特化外绞呈，突觸間隙現(xiàn)在被認(rèn)為是突觸的一個(gè)完整的隔間贸人，有助于它們的結(jié)構(gòu)和功能組織。”

為了繪制裂縫蛋白質(zhì)組佃声，作者采用過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的接近標(biāo)記方法艺智，并將融合于辣根過(guò)氧化物酶的興奮性突觸細(xì)胞粘附蛋白SynCAM1(HRP)作為培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的報(bào)告基因。該報(bào)告基因通過(guò)共聚焦顯微鏡測(cè)量標(biāo)記興奮性突觸秉溉，并通過(guò)3D dSTORM超分辨率成像確定其定位于突觸間隙的邊緣區(qū),用細(xì)胞表面的非膜生物素-酚化合物限制標(biāo)記進(jìn)行接近標(biāo)記力惯，用無(wú)標(biāo)記定量(LFQ)質(zhì)譜結(jié)合膜和突觸表面蛋白的比率HRP標(biāo)記來(lái)鑒定興奮性裂解的蛋白質(zhì)組學(xué)含量碗誉。鑒定了新的候選裂隙蛋白召嘶，并選擇了受體型酪氨酸蛋白磷酸酶zeta并成功驗(yàn)證。作者在本文中支持了過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記在突觸裂蛋白質(zhì)組學(xué)中的強(qiáng)大適用性，以及它在理解健康和精神疾病和成癮等疾病的突觸異質(zhì)性變化方面的潛力弄跌。

《Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins》

01研究結(jié)果

1甲喝、SynCAM 1-過(guò)氧化物酶融合蛋白過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的突觸間隙的鄰近標(biāo)記

SynCAM1，是一種突觸細(xì)胞粘附蛋白铛只，在發(fā)育過(guò)程和成熟突觸中只定位于興奮性突觸贵本。將HRP或APEX2插入SynCAM1的363個(gè)氨基酸位置，位于最后一個(gè)免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域和跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域之間尸校。這將HRP置于SynCAM1的細(xì)胞外區(qū)域的基部穴愕，形成了一個(gè)SynCAM1-HRP融合蛋白，在這個(gè)位置插入的重組蛋白或標(biāo)簽并不會(huì)改變SynCAM1的突觸定位替程。SynCAM1是一種單通道的1型膜蛋白渗蜀，在生物發(fā)生后需要通過(guò)分泌途徑運(yùn)輸?shù)竭_(dá)細(xì)胞表面。為了限制過(guò)氧化物酶融合蛋白介導(dǎo)的生物素標(biāo)記撕陈，通過(guò)分泌途徑進(jìn)入細(xì)胞表面历喊，包括突觸表面，需要一個(gè)含有極性連接物的非膜滲透的生物素-酚化合物生凯。因此法竭，作者選擇了biotin-AEEA-phenol，在過(guò)氧化氫存在的情況下啥葡，外源性biotin-AEEA-phenol誘導(dǎo)了表達(dá)SynCAM1-APEX2的HEK293T細(xì)胞表面的生物素化

圖1. 使用syncam1-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-融合蛋白進(jìn)行過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的接近度標(biāo)記

2蚣殴、繪制興奮性突觸裂蛋白質(zhì)組

2.1 SynCAM1-HRP報(bào)告基因的亞突觸分布

此前，作者利用培養(yǎng)神經(jīng)元中的STED和3DdSTORM超分辨率成像和腦切片中的免疫電鏡分析了內(nèi)源性SynCAM1的突觸表達(dá)容诬。這些方法確定了SynCAM1定位于興奮性娩梨、不對(duì)稱突觸的突觸裂，主要存在于突觸后膜览徒，并在突觸后密度的邊緣被檢測(cè)到狈定。為了分析SynCAM1-HRP報(bào)告基因的定位，作者在HRP的c端插入了一個(gè)flag標(biāo)簽习蓬。用該結(jié)構(gòu)物轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元纽什，并采用雙色三維dSTORM超分辨率成像進(jìn)行分析。FLAG免疫染色檢測(cè)SynCAM1-HRP和突觸后興奮性支架蛋白Homer和3D dSTORM顯示超分辨SynCAM1-HRP位于Homer簇附近(圖2A)躲叼。SynCAM1-HRP集合的分布在PSD邊緣~100nm內(nèi)芦缰，與內(nèi)源性SynCAM1在培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中的亞突觸分布一致。這表明枫慷，基于syncam1的報(bào)告基因?qū)RP靶向到突觸裂隙让蕾，并在裂隙邊界區(qū)富集。

圖2. dSTORM揭示突觸SynCAM1-HRP的表達(dá)和生物素化

2.2 SynCAM1-突觸接近標(biāo)記的HRP驗(yàn)證

突觸裂隙是一種不被細(xì)胞膜包圍的開(kāi)放的細(xì)胞隔室或听。這需要進(jìn)一步提高突觸裂中蛋白質(zhì)鑒定的特異性探孝。一種比率過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的標(biāo)記方法以前曾應(yīng)用于突觸裂蛋白和線粒體膜間間隙蛋白。我們的目的是實(shí)施這種比率測(cè)量方法，并比較由SynCAM1-HRP裂隙報(bào)告基因生物素化的蛋白與細(xì)胞外融合到跨膜結(jié)構(gòu)域的廣泛表面表達(dá)的HRP迈堂。為了驗(yàn)證這兩種報(bào)告基因在神經(jīng)元中正確生成生物素化反應(yīng)產(chǎn)物列啃，我們使用重組AAV(rAAV)在體外14天(div)轉(zhuǎn)導(dǎo)到分離的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)物中。RAAV允許培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)導(dǎo)耀佣，并滴定病毒顆粒以平衡高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和中等蛋白過(guò)表達(dá)屉馋。在添加過(guò)氧化氫和生物素-AEEA-苯酚后，神經(jīng)元在21div處進(jìn)行短暫的過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的接近標(biāo)記钳雄。使用中和病毒素-dylight488對(duì)生物素化產(chǎn)物進(jìn)行染色伶段，發(fā)現(xiàn)在SynCAM1-HRP表達(dá)神經(jīng)元中，興奮性突觸位置的生物素-蛋白偶聯(lián)物匀枪，并有一些突觸外標(biāo)記葱有。相比之下，轉(zhuǎn)導(dǎo)到培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中顯示了樹(shù)突上的生物素標(biāo)記泄廓，但在突觸位置沒(méi)有富集复做。這些結(jié)果支持了SynCAM1-HRP和Membraie-HRP報(bào)告基因可以分別從興奮性突觸分裂和神經(jīng)元細(xì)胞表面獲得鄰近標(biāo)記的蛋白樣本，用于比率分析权浸。

圖 3 SynCAM1-突觸接近標(biāo)記的HRP驗(yàn)證

02研究總結(jié)

過(guò)去的十年中旬渤，隨著超分辨率技術(shù)的整合，作者的數(shù)據(jù)通過(guò)STORM技術(shù)支持了使用突觸HRP報(bào)告基因的接近標(biāo)記是識(shí)別裂隙分子組成的可靠方法奄容，這是一個(gè)以前的生化研究不容易獲得的隔間冰更。未來(lái)的應(yīng)用可以包括測(cè)試在改變突觸結(jié)構(gòu)的疾病相關(guān)條件下，突觸間隙組成的變化昂勒，這提供了證據(jù)蜀细，表明腦裂隙成分有助于暴露藥物濫用后的突觸變化，因此戈盈，裂縫蛋白的鄰近標(biāo)記可能為動(dòng)態(tài)裂縫在形成突觸中的作用提供有價(jià)值的見(jiàn)解奠衔，并為未來(lái)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究繪制這些變化提供了依據(jù)。

在本研究中塘娶，這項(xiàng)2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的發(fā)現(xiàn)已在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化归斤。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現(xiàn)已發(fā)布超高分辨率顯微系統(tǒng) iSTORM ，采用3D隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)技術(shù)刁岸、高精度細(xì)胞實(shí)時(shí)鎖定技術(shù)脏里、多通道同時(shí)成像技術(shù)等，以 納米級(jí)觀測(cè)精度 虹曙、 高穩(wěn)定性 迫横、 廣泛環(huán)境適用 、 快速成像 露您、 簡(jiǎn)易操作 等優(yōu)異特性飘缨，獲得了超過(guò)50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可水仑。

參考文獻(xiàn)：

1. Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins

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