什么是隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM哲思？

它有什么應(yīng)用？

高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)（TGN）和核內(nèi)體是分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中重要的蛋白質(zhì)分選站。蛋白質(zhì)分選基本上是一個(gè)空間分離的過程摸进，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中卡催，尚未以高分辨率系統(tǒng)地分析構(gòu)成分選機(jī)制的蛋白質(zhì)之間的空間關(guān)系完冻。在這里婿滓，作者借助STORM成像啼辣，表明TGN/內(nèi)涵體定位的貨物銜接子AP-1邻薯，GGA2和epsinR裙戏，在近核高爾基體區(qū)域形成長(zhǎng)度超過250納米的伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)乘凸。作者的數(shù)據(jù)表明，TGN/內(nèi)涵體定位的貨物銜接子具有明顯的空間關(guān)系累榜∮冢空間分離的貨物銜接子GGA2和AP-1分別調(diào)節(jié)Frizzled6和Vangl2的分選，并且空間相關(guān)的貨物銜接子可以協(xié)同調(diào)節(jié)特定的分選過程癣辉。

NO.1研究介紹（節(jié)選）

在這里模鹿，作者利用隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）以高分辨率提供參與TGN/內(nèi)體分選過程的蛋白質(zhì)空間分布的更廣泛視圖。STORM成像在同一照相機(jī)幀中同時(shí)捕獲兩種熒光染料以實(shí)現(xiàn)20nm的空間分辨率传起。作者揭示了貨物銜接子AP-1和GGA2是空間分離的挚雾，它們分別介導(dǎo)平面細(xì)胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6的分選。超分辨率成像研究顯示Frizzled6和Vangl2在空間上與不同的網(wǎng)格蛋白銜接子相關(guān)掺挺，提供了差異貨物分選過程的直接觀察钩氓。

NO.2研究結(jié)果（節(jié)選）

1.網(wǎng)格蛋白與TGN/內(nèi)體定位的貨物銜接子的空間關(guān)系分析

為了測(cè)試STORM是否可以用于比較不同高爾基體定位蛋白之間的空間關(guān)系，作者分析了順式高爾基體標(biāo)記GM 130和反式高爾基體標(biāo)記Golgin-97的定位模式狰丝。使用常規(guī)光學(xué)顯微鏡织刹，GM 130的定位模式與Golgin 97的定位模式?jīng)]有明顯區(qū)別（圖1A）,相反，用STORM化团，作者觀察到GM 130與Golgin-97的明顯分離（圖1B佛岛，C）。因此辐荷，STORM是揭示不同高爾基體定位蛋白質(zhì)之間空間關(guān)系的可行工具烫饼。

（A，B）通過常規(guī)熒光顯微鏡（A）或通過STORM（B）可視化的相同COS7細(xì)胞中的順式高爾基體標(biāo)記（GM130）和反式高爾基體標(biāo)記（高爾基體-97）的定位模式试读。比例尺杠纵，500 nm。(C)（B）中所示區(qū)域的放大圖钩骇。比例尺比藻，100 nm。(D)STORM技術(shù)揭示了兩種不同熒光染料標(biāo)記的順式高爾基體標(biāo)記物（GM130）在COS7細(xì)胞中的定位模式倘屹。比例尺银亲，500 nm。(E)（D）中所示區(qū)域的放大圖纽匙。比例尺务蝠，100 nm。(F)基于從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的四個(gè)超分辨率圖像烛缔，量化GM130和Golgin-97之間以及Alexa Fluor 750標(biāo)記的GM130和Alexa Fluor 647標(biāo)記的GM130之間的重疊像素百分比（平均值± SD）馏段。* ** p〈0.001，采用雙尾Student t檢驗(yàn)践瓷。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白在整個(gè)核旁區(qū)域中的定位模式亭颈。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)婚廷。

使用STORM，作者試圖分析COS7細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白和貨物銜接子之間的空間關(guān)系悠蹬。作者選擇了大部分貨物銜接子位于其中的整個(gè)近核高爾基區(qū)用于以下超分辨率成像分析藏苫。這一分析表明，STORM可以檢測(cè)到網(wǎng)格蛋白在囊泡外殼周圍的環(huán)狀定位跛拌。

圖2 近核區(qū)貨物銜接子與網(wǎng)格蛋白的空間關(guān)系分析

(A-G用抗網(wǎng)格蛋白重鏈和γ 1-adaptin的抗體共染色COS7細(xì)胞信炬。應(yīng)用STORM技術(shù)分析了γ 1-adaptin標(biāo)記的AP-1和網(wǎng)格蛋白重鏈標(biāo)記的網(wǎng)格蛋白在COS7細(xì)胞中的二維（A-C）和三維（D-G "）定位模式。（A却痴，D）中指示區(qū)域的放大圖分別顯示在（B移蔼，C）和（E-G "）中。(H-K'）.用epsinR-FLAG轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞咏逛。轉(zhuǎn)染后第1天，細(xì)胞用抗γ 1-adaptin抗體和FLAG標(biāo)簽共染色奢惋。STORM分析同一COS7細(xì)胞中epsinR-FLAG和網(wǎng)格蛋白重鏈的空間定位模式预隆。（H）中指定區(qū)域的放大圖見（I-K "）。(L-O用抗網(wǎng)格蛋白重鏈和GGA2的抗體共染色COS7細(xì)胞啸盲。STORM技術(shù)分析GGA2和網(wǎng)格蛋白重鏈在同一COS7細(xì)胞中的三維定位模式膳灶。（L）中指定區(qū)域的放大圖見（M-O "）。(P-R)COS7細(xì)胞與抗網(wǎng)格蛋白重鏈和AP3 δ 1的抗體共染色立由。應(yīng)用STORM分析AP3 δ 1和網(wǎng)格蛋白重鏈標(biāo)記的AP-3在COS7細(xì)胞中的二維定位模式轧钓。圖P中所示區(qū)域的放大圖顯示在（Q，R）中锐膜。(S)基于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3次獨(dú)立重復(fù)采集的超分辨率圖像毕箍，定量與網(wǎng)格蛋白相關(guān)的AP-1、GGA2道盏、AP-3或epsinR斑點(diǎn)組分（平均值± SD而柑，基于≥ 9張超分辨率圖像）。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個(gè)近核區(qū)域中的定位模式荷逞，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子媒咳。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。

2.TGN/核內(nèi)體定位的貨物銜接子空間關(guān)系分析

接下來种远，作者以精細(xì)分辨率分析了TGN和內(nèi)體定位的貨物銜接子之間的空間關(guān)系涩澡。

AP-1和epsinR的超分辨率成像分析顯示一些epsinR結(jié)構(gòu)與AP-1結(jié)構(gòu)相關(guān)（圖3E-H，和圖3I中的定量）和一些AP-1和epsinR結(jié)構(gòu)彼此分離（圖3E坠敷，G）汹涯。

圖3 近核區(qū)網(wǎng)格蛋白銜接子的空間關(guān)系分析

(A-D，N-Q）COS 7細(xì)胞與γ1-adaptin和δ3-adaptin抗體共染色或與γ1-adaptin和GGA 2抗體共染色数屁。然后使用STORM來可視化AP-1和AP-3的定位（A-D）以及AP-1和GGA 2的定位（N-Q）渡表。(E-H娶讽，J-M）。用epsinR-FLAG轉(zhuǎn)染COS 7細(xì)胞赐罪。轉(zhuǎn)染后第1天涉等，用抗γ1-適應(yīng)素和FLAG標(biāo)簽的抗體（E-H）或抗GGA 2和FLAG標(biāo)簽的抗體（J-M）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共染色。然后使用STORM可視化γ1和epsinR-FLAG的定位以及GGA 2和epsinR-FLAG的定位详础。（A程挑、E、J普易、N）中指定區(qū)域的放大視圖如（B-D臊耳、F-H、K-M畜股、O-Q）所示颈侈。顯示了每個(gè)面板的比例尺。（I闷旧，R）定量與epsinR或AP-3相關(guān)的AP-1斑點(diǎn)百分比（I）长豁，定量與epsinR或AP-1相關(guān)的GGA 2斑點(diǎn)百分比（R）（平均值± SD，基于≥7張超分辨率圖像）忙灼。***p〈0.001匠襟，采用雙尾Student t檢驗(yàn)。AP-1和AP-3分別用抗γ1和δ3抗體標(biāo)記该园。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個(gè)近核區(qū)域中的定位模式酸舍，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)里初。定量分析基于從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三次獨(dú)立重復(fù)獲得的超分辨率圖像啃勉。

3.通過超分辨率成像分析可視化平面細(xì)胞極性蛋白Vangl2和Frizzled6在TGN離開時(shí)的分選

作者選擇了大部分Vangl2定位的近核區(qū)域用于超分辨率成像分析。STORM成像分析顯示双妨，大多數(shù)Vangl2 Y279A璧亮、Y280A點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)不與AP-1相鄰（圖4J、U）斥难。接下來作者試圖用STORM觀察這些分選過程枝嘶。

圖4 Vangl2和Frizzled6在通過STORM退出TGN時(shí)的分類可視化

(A-H用HA-Vangl2（wt）轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第1天蟹梗，將細(xì)胞在20 ℃下孵育2 h膜暴，然后在32 ℃下孵育5 min。孵育后尚稍，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-1 γ亞基在二維（A-D）和三維（E-H "）的定位道暑。（A）中指示區(qū)域的放大圖見（B-D）。（E）中指示區(qū)域的放大圖見（F-H）竭珊。（F-H）的180 °旋轉(zhuǎn)視圖如（F'- H'）所示人蕊。顯示了每張圖像的比例尺葬聘。(I-K)用HA-Vangl2（wt）或HA-Vangl2 Y279A、Y280A或HA-Frizzled6轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞锤镀。轉(zhuǎn)染后第1天赖相，將細(xì)胞在20 ℃下孵育2 h，然后在32 ℃下孵育5 min手索。孵育后钳骚，用STORM觀察Vangl2（wt）和AP-3 δ亞基（I），Vangl2 Y279A唱枝、Y280A和AP-1 γ亞基（J）貌嫡，F(xiàn)rizzled6和AP-1 γ亞基（K）的定位。比例尺该溯，500 nm岛抄。(L-Q)COS7細(xì)胞用HA-Vangl2（L）或HA-Frizzled6（M-P）轉(zhuǎn)染或用epsinR-FLAG和HA-Frizzled6（Q-T）共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第1天狈茉，將細(xì)胞在20 ℃下孵育2 h夫椭，然后在32 ℃下孵育5 min。溫育后论皆，使用雙色STORM來顯現(xiàn)Vangl2和GGA2（L）益楼、Frizzled6和GGA2（M-P）或epsinR-FLAG和Frizzled6（Q）的定位猾漫。（M点晴，Q）中指示區(qū)域的放大圖如（N-P，R-T）所示悯周。(U)與指定貨物相關(guān)的Vangl2或Frizzled6斑點(diǎn)百分比的定量|適配器（平均值± SD粒督，基于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組≥ 6張超分辨率圖像）。* * p〈0.01禽翼，*** p〈0.001屠橄，采用雙尾Student t檢驗(yàn)。超分辨率圖像顯示了所指示蛋白質(zhì)在整個(gè)近核區(qū)域中的定位模式硫忆，其中定位了大多數(shù)貨物銜接子筷资。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)近核高爾基區(qū)的數(shù)據(jù)。定量分析基于從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三次獨(dú)立重復(fù)獲得的超分辨率圖像袭丛。(V)所提出的模型顯示AP-1胃宰、AP-3、epsinR和GGA2在TGN和內(nèi)體膜上的不同微結(jié)構(gòu)域上組裝成具有不同空間關(guān)系的伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)：空間分離的GGA2和AP-1分別調(diào)控Frizzled6和Vangl2的分選;空間相關(guān)的貨物銜接子GGA2和epsinR共同調(diào)節(jié)Frizzled6的分選饲骂。

NO.3研究討論（節(jié)選）

STORM超高分辨率成像分析也揭示了AP1結(jié)構(gòu)與GGA2結(jié)構(gòu)在很大程度上是分離的垦适，并且至少存在兩個(gè)epsinR群，一個(gè)與AP-1相關(guān)旋逛，另一個(gè)與GGA2相關(guān)（圖4V）.在酵母中矛塑，這些觀察結(jié)果表明析口，從酵母到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，貨物銜接子之間的空間關(guān)系是保守的媳厕。

總之乱归，STORM超高分辨率成像分析表明，貨物銜接子AP-1听想、AP-3和GGA 2在TGN或核內(nèi)體的不同出口結(jié)構(gòu)域組裝成大的細(xì)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)腥刹，以介導(dǎo)特定貨物分子的分選（圖4V）『郝颍空間分離的GGA 2和AP-1分別調(diào)節(jié)Frizzled 6和Vangl 2的分選衔峰。空間相關(guān)的貨物銜接子GGA 2和epsinR共同調(diào)控Frizzled 6的分選蛙粘。

在本研究中垫卤，研究者主要借助STORM超分辨率顯微鏡來研究高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)體蛋白質(zhì)分選可視化，目前在國(guó)內(nèi)出牧，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實(shí)現(xiàn)商用穴肘，有需要STORM成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的專家老師們，可預(yù)約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務(wù)~

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