“ RNA polymeraseII（RNAPII）負責大多數(shù)真核生物蛋白編碼基因的轉錄。分析RNAPII的拓撲分布和定量有助于理解其在細胞間期的功能。以前的研究表明，RNAPII分子在分化的擬南芥核的異染色質中形成網(wǎng)狀結構，而不是像在哺乳動物核中觀察到的那樣組織在不同的 "轉錄工廠 "中。 ”

通過結構化照明顯微鏡（SIM）獲得的圖像堆棧的最大強度投影中基于特定抗體標記的免疫信號強度測量表明內多倍體植物核中RNAPII的相對比例增加。本研究中應用光活化定位顯微鏡（PALM）來確定分化的擬南芥核中活性和非活性RNAPII分子的絕對數(shù)量和分布。在內多倍體化過程中RNAPII的比例增加得到證實，同時也證明了PALM的測量在定量方面比基于SIM的測量更可靠。單分子定位結果表明，雖然RNAPII分子在植物常染色質內全局分散，但它們也像哺乳動物轉錄工廠所描述的那樣在較小的距離內聚集。

《Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei》

01研究結果（節(jié)選）

1、結合SIM和PALM對擬南芥核中RNAPII進行超分辨率成像

大多數(shù)真核基因由RNAPII轉錄，細胞核中活性RNAPII的數(shù)量反映了轉錄的程度。電子和光學顯微鏡證明了轉錄本和RNAPII的共定位。根據(jù)其在基因上的位置和轉錄階段，RNAPII被不同程度地磷酸化，而無活性的RNAPII主要是未磷酸化的。在哺乳動物中，RNAPII被認為是組織在不同的所謂 "轉錄工廠 "中，研究發(fā)現(xiàn)，轉錄工廠的直徑和其中RNAPII分子的個數(shù)的高變異性不僅是由分析的不同細胞類型引起的，而且是由應用的不同成像方法引起的，而超分辨率顯微成像技術，如結構化照明顯微鏡（SIM）和光活化定位顯微鏡（PALM），以超出光的衍射極限的高精度定位單個分子，可以更可靠地計數(shù)細胞中的分子。

細胞核被標記針對活性和非活性RNAPII的特異性抗體，結合應用SIM與3D-PALM。在SIM圖像中確定RNAPII酶的分布后，網(wǎng)狀結構變得可見。通過3D-PALM以記錄單個閃爍分子的數(shù)量和定位。當分子被渲染到獲得的定位精度時，除了缺乏RNAPII的核仁，活性和非活性 RNAPII分子均勻分布在整個細胞核中。SIM與PALM的組合以及不同RNAPII分子與同一細胞核中熒光團 Alexa488 和 Cy5 的同時標記允許單個分子定位在網(wǎng)狀結構內。沒有出現(xiàn)活性和非活性RNAPII的共定位，表明這兩種分子在常染色質內占據(jù)不同的區(qū)域。

圖1. 擬南芥葉核中RNAPII分子的分布

2、使用3D-PALM對RNAPII分子分布情況進行分析

超分辨率顯微鏡還可以評估生物標本的第三維，本研究中首次通過應用3D-PALM確定了分化的內多倍體植物細胞核中RNAPII分子的數(shù)量。由于存在更多分子，活性RNAPII顯示出比非活性更高的全局密度。這兩種RNAPII都表現(xiàn)出相似的聚集行為，并且規(guī)律出現(xiàn)高積累位點。對于活性和非活性RNAPII，小簇內單個RNAPII分子之間的距離在20nm和40nm之間。對于活性和非活性RNAPII，存在小簇之間進一步積累的區(qū)域。因此，除了常染色質內兩種RNAPII分子的全局分散外，RNAPII分子也可能在兩個不同的水平上聚集。盡管平均單分子距離為27nm，但活性RNAPII分子比非活性分子更密集地聚集在小距離和大距離簇中。大小簇對應于已知的動物轉錄工廠的大小。

圖2. 由3D-PALM記錄的8C擬南芥核中非活性和活性RNAPII分子的分布

圖3. 活性RNAPII（Ser2ph）的分布和聚集情況

3、RNAPII分子的數(shù)量與內多倍體的關系

研究者利用3D-PALM還估計了整個細胞核內活性和非活性RNAPII的拷貝數(shù)。在分化的2C和內多倍體4C-16C葉核中，活性RNAPII（Ser2ph）的平均數(shù)量增加，范圍在2C中的~13000和16C中的~58000之間。然而，在核內復制過程中精確酶復制的情況下，分子數(shù)量并未如理論上所預期的那樣按比例增加。

圖4. 2C–16C核中活性RNAPII（Ser2ph）的平均數(shù)

4、一種內多倍體植物間期細胞核的組織模型

先前的研究結果表明，染色體結構維持凝聚蛋白（SMC）和凝聚蛋白復合亞基SMC3和CAP-D3，分別在分化的內多倍體擬南芥核常染色質內顯示出類似于 RNAPII的網(wǎng)狀分布?；诖?，研究者提出了一個模型（圖5）：兩個不同的相鄰染色體臂區(qū)域（藍色和白色），異染色質高度濃縮。姐妹染色單體的常染色質由約50kb的染色質片段組成，這些片段進一步聚集。姐妹染色單體片段可以是內聚的或分開的。染色質纖維可能發(fā)源于RNAPII分子聚集的地方，并在潛在的轉錄工廠中被激活。無活性的RNAPII分子，大部分也聚集分布在常染色質內。SMC3和CAP-D3亞基均勻分布，可能負責維持靈活的常染色質組織。

圖5. RNAPII和SMC蛋白復合物亞基（SMC3和CAP-D3）在間期植物核常染色質內的排列模型

02研究總結

1.由不同的RNAPII形成的網(wǎng)狀結構，包含一些主要全局分散的單分子，它們可能聚集成已知的動物“轉錄工廠”的尺寸；

2.通過3D-PALM定量RNAPII比SIM圖像堆棧生成的最大強度投影的信號強度測量更可靠；

3.3D-PALM測量證實RNAPII分子的數(shù)量隨著內多倍體的程度增加。

參考文獻

References

1.Schubert, Veit, and Klaus Weisshart. "Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei." Journal of experimental botany 66.6 (2015): 1687-1698.

在本研究中，研究者主要借助3D-PALM超分辨率顯微鏡來研究RNAPII，3D-PALM與3D-STORM原理相似，目前在國內，隨機光學重建顯微鏡STORM已成功實現(xiàn)商用，有需要STORM成像技術進行實驗研究的專家老師們，請文末填寫問卷，即可預約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務~

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