隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，簡稱STORM)挑乓，是一種超分辨率顯微鏡牌废，其分辨率比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上。

我們知道参挨，光學顯微鏡憑借其非接觸刮盗、無損傷等優(yōu)點犬耀，長期以來是生物醫(yī)學研究的重要工具。但由于光的衍射限制了光學顯微鏡的分辨率书县，傳統(tǒng)的顯微鏡已經不適于生命科學研究中的超微結構成像了把鹊。本文將從原理、應用等方面對隨機光學重建顯微鏡STORM進行相關研究叉屠，歡迎各位老師討論交流伏尼。

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光的衍射

限制了光學顯微鏡的分辨率

在了解STORM之前，需要先知悉一個概念尉尾。眾所周知爆阶，光學顯微鏡是用可見光來觀察生物樣品的。而光是一種橫波沙咏，當它經過一個圓孔辨图，且這個圓孔的大小與光的波長差別不大時，光在此時不會沿直線傳播肢藐，而是在各個方向上“溜走”徒役。光在傳播過程中，遇到障礙物或小孔時窖壕，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象忧勿，這就叫光的衍射。

由此而形成的圓孔衍射圖樣瞻讽，叫“艾里斑”（圖1）鸳吸。正因如此，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無法把光線在像平面匯聚成無限小的點速勇，而是只能形成有限大小的艾里斑晌砾。如果兩個點很接近，像平面上的兩個艾里斑就幾乎重合在一起欠慢，那物平面上的兩個點就不可分辨了衫荒。

圖1、“艾里斑”概念圖

所以笋夸，光的衍射使得光學顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)液啃，使得傳統(tǒng)顯微鏡無法清晰觀察尺寸在200 nm以內的生物結構,極大制約了生命科學研究的發(fā)展。

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超分辨率顯微鏡

打破分辨率極限

科研工作者為了看到更精細的生命體精細結構椿啦，就要想辦法突破這一成像障礙墨仰。為此，多種超分辨率顯微鏡被開發(fā)了出來（超越了光學顯微鏡的分辨率極限估董，故被稱為超分辨顯微鏡）拯耿。在這里，我們集中討論其中這樣一個具有相對優(yōu)勢的顯微鏡：隨機光學重建顯微鏡STORM。

在2006年的Nature上射粹，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉化的發(fā)光分子團暑尝，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術，并將其命名為隨機光學重建顯微鏡雅镊，簡稱STORM襟雷。

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隨機光學重建顯微鏡STORM

技術原理簡介

正如前面提到的那樣，兩個挨得很近的光點會讓我們分辨不出誰是誰漓穿，那么如果我們分開來看呢嗤军？

也就是說，當我們照射并觀察第一個點時晃危，第二個點并不會發(fā)光叙赚，自然不會產生艾里斑影響我們觀察第一個點，前者艾里斑的中心點位置就是熒光分子的準確位置僚饭。接下來震叮，通過某種方法，讓第二個點被照亮鳍鸵。這個時候第一個點又不在光斑的照明范圍之內了苇瓣，同樣不會干擾對第二個點的觀察。通過這種“以時間換空間”的設計偿乖，巧妙地繞開了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛击罪，將光學顯微鏡的分辨率大大提高。

STORM技術就運用了這種思想滨胰，它使用的是有機熒光分子對染料崭夺，并且通過一些方法使細胞內的一小部分熒光分子發(fā)光，而不是全部感栋。這樣由于發(fā)光的點分布比較分散史代，重疊比較少，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子姥仍。在一次激發(fā)中乐玛，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發(fā)中傻牙，可以確定另外一部分光暈的中心纪立，把這許多次激發(fā)的結果疊加，就是完整而清晰的圖像青礁。

STROM成像過程包含一系列圖像循環(huán)燃徊。每個循環(huán)中，只打開視野下一部分熒光基團谋监，這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊本鸣。這樣確定了基團的準確位置疫衩，多次重復這個過程，每次隨機打開熒光基團的不同亞基荣德，得到圖像闷煤，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成清晰的整個圖像涮瞻。理論上STORM可得到分辨率達到幾個納米的熒光圖像鲤拿。

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隨機光學重建顯微鏡STORM

技術應用案例

隨機光學重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術，能夠在二維或三維署咽、多種顏色下成像近顷，甚至可以對活細胞成像。這種成像技術的方法根據(jù)正在成像的內容宁否、如何成像以及正在產生的圖像類型而變化很大窒升，可以應用于生命科學的許多領域，并為從神經科學到亞細胞科學的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像慕匠。自STORM技術被提起以來饱须，越來越多的研究人員認識到了這項技術的優(yōu)勢并廣泛運用于研究中。

（以近些年的部分研究成果為例）

2013年隔阔，cell 雜志上的一篇研究報告：莊小威團隊利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對端粒 DNA 進行原位成像果孝，直接可視化染色質中的 T 環(huán)結構，并系統(tǒng)地評估保護蛋白在 T 環(huán)形成中的作用贵式。（點此查看原文）

圖3炼缰、STORM 成像顯示染色質擴散后的 T 環(huán)

2017年，Liu Riyue團隊開發(fā)了一種光漂白的方法蚜玲，以有效地降低藍藻和植物細胞的自身熒光并利用STORM技術在球形藍藻原綠球菌和開花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率浓先。（點此查看原文）

圖4、雙Z環(huán)的STORM圖像

2018年结憾，Lin, Danying團隊提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法矢老，擴展了多層 3D STORM的成像深度，并顯示了COS-7 細胞中微管遗赘、線粒體和內質網的三通道斋葱、擴展深度 3D prSTORM圖像。（點此查看原文）

圖5疾词、 COS-7 細胞中微管溃蛙、線粒體和內質網的三通道、擴展深度 3D prSTORM 圖像

2019绑咱，Schlegel J ,  Peters S ,  Doose S 團隊通過直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）進行超分辨率顯微鏡觀察绰筛，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集枢泰，突出了其對細菌侵襲的重要意義。（點此查看原文）

圖6铝噩、表達GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021衡蚂，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術發(fā)現(xiàn)，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部骏庸，IFT亞基位于九個不同的位點毛甲，在它們進入纖毛干之前，IFT蛋白以高親和力途弑唬靠在纖毛基部的9個位點玻募。（點此查看原文）

色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術發(fā)現(xiàn)一姿，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部七咧，IFT亞基位于九個不同的位點，在它們進入纖毛干之前啸蜜，IFT蛋白以高親和力统鹊蓿靠在纖毛基部的9個位點。（點此查看原文）

圖7部竟、IFT顆粒蛋白的定位元渺，N-或C-末端3HA標記的IFT蛋白、KIN1/KIF3A驅動蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側（側）視圖的STORM圖像庵无。

2021勉溉，Blandin, Anne-Florence團隊利用球狀體膠質瘤細胞擴散的體外模型，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細胞比表達α5的細胞對TKIs更敏感娩戳。（點此查看原文）

圖8肯锻、吉非替尼處理的細胞的雙色dSTORM圖像顯示細胞外周和核內體上的EGFR/β1整合素復合體

STORM因為其優(yōu)異的單分子成像能力，越來越多的被用在細胞精細結構的探索更践。對STORM的更多研究將提供更有效的方法來制備樣品和成像樣品户犯，以及提供更高分辨率的圖像。相信在未來這項技術能得到進一步發(fā)展藏络，變成功能更為強大的利器糜透。