隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，簡稱STORM)隘蝎，是一種超分辨率顯微鏡周霉，其分辨率比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上享甸。

我們知道歇肖，光學顯微鏡憑借其非接觸茎冒、無損傷等優(yōu)點，長期以來是生物醫(yī)學研究的重要工具百览。但由于光的衍射限制了光學顯微鏡的分辨率映情，傳統(tǒng)的顯微鏡已經(jīng)不適于生命科學研究中的超微結(jié)構(gòu)成像了。本文將從原理笑杯、應用等方面對隨機光學重建顯微鏡STORM進行相關研究阱墩，歡迎各位老師討論交流。

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光的衍射

限制了光學顯微鏡的分辨率

在了解STORM之前辱得，需要先知悉一個概念局该。眾所周知，光學顯微鏡是用可見光來觀察生物樣品的沉享。而光是一種橫波涉佑，當它經(jīng)過一個圓孔，且這個圓孔的大小與光的波長差別不大時砂裹，光在此時不會沿直線傳播贬池，而是在各個方向上“溜走”。光在傳播過程中文黎，遇到障礙物或小孔時惹苗，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象，這就叫光的衍射耸峭。

由此而形成的圓孔衍射圖樣桩蓉，叫“艾里斑”（圖1）。正因如此劳闹，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無法把光線在像平面匯聚成無限小的點院究，而是只能形成有限大小的艾里斑。如果兩個點很接近本涕，像平面上的兩個艾里斑就幾乎重合在一起业汰，那物平面上的兩個點就不可分辨了。

圖1、“艾里斑”概念圖

所以样漆，光的衍射使得光學顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)为障，使得傳統(tǒng)顯微鏡無法清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu),極大制約了生命科學研究的發(fā)展。

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超分辨率顯微鏡

打破分辨率極限

科研工作者為了看到更精細的生命體精細結(jié)構(gòu)放祟，就要想辦法突破這一成像障礙鳍怨。為此，多種超分辨率顯微鏡被開發(fā)了出來（超越了光學顯微鏡的分辨率極限巾妖，故被稱為超分辨顯微鏡）估横。在這里，我們集中討論其中這樣一個具有相對優(yōu)勢的顯微鏡：隨機光學重建顯微鏡STORM牵梗。

在2006年的Nature上台筷，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉(zhuǎn)化的發(fā)光分子團，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術洗筛，并將其命名為隨機光學重建顯微鏡夷著，簡稱STORM。

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隨機光學重建顯微鏡STORM

技術原理簡介

正如前面提到的那樣凸窖，兩個挨得很近的光點會讓我們分辨不出誰是誰，那么如果我們分開來看呢霹补？

也就是說天证，當我們照射并觀察第一個點時，第二個點并不會發(fā)光十匆，自然不會產(chǎn)生艾里斑影響我們觀察第一個點哀买，前者艾里斑的中心點位置就是熒光分子的準確位置。接下來柬赐，通過某種方法亡问，讓第二個點被照亮。這個時候第一個點又不在光斑的照明范圍之內(nèi)了肛宋，同樣不會干擾對第二個點的觀察州藕。通過這種“以時間換空間”的設計，巧妙地繞開了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛酝陈，將光學顯微鏡的分辨率大大提高床玻。

STORM技術就運用了這種思想，它使用的是有機熒光分子對染料沉帮，并且通過一些方法使細胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光锈死，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點分布比較分散穆壕，重疊比較少待牵，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子。在一次激發(fā)中，可以確定一部分光暈的中心缨该，在下一次激發(fā)中偎行，可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加摆采，就是完整而清晰的圖像猬笑。

STROM成像過程包含一系列圖像循環(huán)。每個循環(huán)中选从，只打開視野下一部分熒光基團呜颓，這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開麦咪，不重疊候摹。這樣確定了基團的準確位置，多次重復這個過程娄勒，每次隨機打開熒光基團的不同亞基她添，得到圖像，確定每個亞基的位置后馋奠，把以上圖像重建成清晰的整個圖像屎洒。理論上STORM可得到分辨率達到幾個納米的熒光圖像。

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隨機光學重建顯微鏡STORM

技術應用案例

隨機光學重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術丰吐，能夠在二維或三維虑稼、多種顏色下成像，甚至可以對活細胞成像势木。這種成像技術的方法根據(jù)正在成像的內(nèi)容蛛倦、如何成像以及正在產(chǎn)生的圖像類型而變化很大，可以應用于生命科學的許多領域啦桌，并為從神經(jīng)科學到亞細胞科學的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像溯壶。自STORM技術被提起以來，越來越多的研究人員認識到了這項技術的優(yōu)勢并廣泛運用于研究中甫男。

（以近些年的部分研究成果為例）

2013年且改，cell 雜志上的一篇研究報告：莊小威團隊利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對端粒 DNA 進行原位成像，直接可視化染色質(zhì)中的 T 環(huán)結(jié)構(gòu)查剖，并系統(tǒng)地評估保護蛋白在 T 環(huán)形成中的作用钾虐。（點此查看原文）

圖3、STORM 成像顯示染色質(zhì)擴散后的 T 環(huán)

2017年笋庄，Liu Riyue團隊開發(fā)了一種光漂白的方法效扫，以有效地降低藍藻和植物細胞的自身熒光并利用STORM技術在球形藍藻原綠球菌和開花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率。（點此查看原文）

圖4直砂、雙Z環(huán)的STORM圖像

2018年计侯，Lin, Danying團隊提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法帝畸，擴展了多層 3D STORM的成像深度，并顯示了COS-7 細胞中微管傻当、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道邀安、擴展深度 3D prSTORM圖像。（點此查看原文）

圖5堤型、 COS-7 細胞中微管扬瘸、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴展深度 3D prSTORM 圖像

2019教物，Schlegel J ,  Peters S ,  Doose S 團隊通過直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）進行超分辨率顯微鏡觀察乌骇，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集，突出了其對細菌侵襲的重要意義糊争。（點此查看原文）

圖6序摔、表達GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術發(fā)現(xiàn)婴鞭，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部柱悬，IFT亞基位于九個不同的位點，在它們進入纖毛干之前未斑，IFT蛋白以高親和力凸舅蓿靠在纖毛基部的9個位點。（點此查看原文）

色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021蜡秽，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團隊運用STORM技術發(fā)現(xiàn)荠列，表達IFT融合蛋白的細胞在纖毛基部，IFT亞基位于九個不同的位點载城，在它們進入纖毛干之前，IFT蛋白以高親和力头丫停靠在纖毛基部的9個位點诉瓦。（點此查看原文）

圖7、IFT顆粒蛋白的定位力细，N-或C-末端3HA標記的IFT蛋白睬澡、KIN1/KIF3A驅(qū)動蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側(cè)（側(cè)）視圖的STORM圖像。

2021眠蚂，Blandin, Anne-Florence團隊利用球狀體膠質(zhì)瘤細胞擴散的體外模型煞聪，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細胞比表達α5的細胞對TKIs更敏感。（點此查看原文）

圖8逝慧、吉非替尼處理的細胞的雙色dSTORM圖像顯示細胞外周和核內(nèi)體上的EGFR/β1整合素復合體

STORM因為其優(yōu)異的單分子成像能力讹荣，越來越多的被用在細胞精細結(jié)構(gòu)的探索。對STORM的更多研究將提供更有效的方法來制備樣品和成像樣品保跨，以及提供更高分辨率的圖像合杜。相信在未來這項技術能得到進一步發(fā)展秽烫，變成功能更為強大的利器。