傳統(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率限制阻礙了病毒蛋白的可視化，因?yàn)槿魏螁蝹€(gè)熒光信號(hào)的尺寸通常大于大多數(shù)病毒粒子驱请。超分辨率顯微鏡有可能在接近電子顯微鏡的分辨率下揭示蛋白質(zhì)的分布，而不依賴于EM中所需的生物標(biāo)本的現(xiàn)有特征的形態(tài)特征。
人類免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 近似球形壶碴，平均直徑為125 ± 14 nm 刮血。它的主要結(jié)構(gòu)成分是含有包膜糖蛋白的脂質(zhì)雙層麻顶，位于病毒脂質(zhì)膜下方的基質(zhì)殼和具有錐形幾何形狀的衣殼核心。HIV-1蛋白的熒光標(biāo)記為它們?cè)诟腥炯?xì)胞中的亞細(xì)胞定位提供了有價(jià)值的見解压鉴。然而，由于病毒顆粒小于常規(guī)熒光顯微鏡的分辨率極限锻拘，因此難以檢測細(xì)胞進(jìn)入和復(fù)制的分子機(jī)制油吭。 電子顯微鏡技術(shù)提供了結(jié)構(gòu)對(duì)HIV-1的見解,但在技術(shù)上仍然要求很高，并且容易引入人工制品署拟。該技術(shù)在感染過程中具有可視化病毒蛋白分子組織的巨大潛力婉宰，尤其是在用熒光蛋白標(biāo)記會(huì)損害病毒感染性的情況下。以前的研究已經(jīng)使用超分辨率技術(shù)來可視化人工轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中的病毒蛋白簇。在這項(xiàng)研究中心包，作者使用dSTORM提供了真正感染淋巴樣細(xì)胞之前和之后感染性HIV-1顆粒中基質(zhì)和衣殼蛋白的分子分布之一宁路。
作者使用dSTORM可視化無細(xì)胞HIV-1病毒體和感染的淋巴樣細(xì)胞中的基質(zhì)和衣殼蛋白。首先產(chǎn)生了包含綠色熒光蛋白-病毒蛋白R(shí)融合蛋白 (hivgfp-vpr) 的HIV-1顆粒辛辱，這使作者能夠用常規(guī)熒光顯微鏡觀察顆粒猩肪。然后將相同的病毒體制劑均勻地涂在玻璃蓋玻片上或用于感染淋巴細(xì)胞。重要的是唱忠，在允許病毒進(jìn)入靶細(xì)胞20分鐘后旷糟，通過鏈蛋白酶處理從靶細(xì)胞表面去除非內(nèi)化的病毒顆粒。這通過將靶細(xì)胞與包膜缺陷型HIV-1孵育得到證實(shí)临卿，所述包膜缺陷型細(xì)胞不能進(jìn)入靶細(xì)胞巾鹰，因此被鏈霉蛋白酶切割，因此在這些樣品中不能檢測到病毒蛋白 (圖1)卒割。
圖1 鏈蛋白酶處理從細(xì)胞表面去除非內(nèi)化的病毒顆粒
MT-2細(xì)胞在17 °C下用 (a泛滔，c) HIVGFP-Vpror (b，d) HIVΔenvGFP-Vpr感染2小時(shí)堂憔，以使病毒體與細(xì)胞結(jié)合寡花。之后，將細(xì)胞洗滌以除去未結(jié)合的病毒顆粒奥猎，并在37 °C下孵育20分鐘昼钻，以使病毒進(jìn)入細(xì)胞。然后將樣品分開封寞，將一半的細(xì)胞與PBS (a-b) 孵育然评，而另一半用鏈蛋白酶 (c-d) 處理以去除非內(nèi)在化的病毒顆粒。隨后狈究，通過寬視場顯微鏡碗淌，然后進(jìn)行反卷積，對(duì)所有樣品進(jìn)行固定抖锥，反染色亿眠，安裝和可視化。GFP以綠色顯示磅废，核以藍(lán)色顯示纳像。所提供的圖像是從以0.3 μ m步長拍攝的28個(gè)圖像的z堆疊的體積壓縮得出的。
因此拯勉，與淋巴細(xì)胞相關(guān)的所有基質(zhì)和衣殼蛋白簇均被內(nèi)化竟趾。通過細(xì)胞因子離心將感染的細(xì)胞固定并鋪在玻璃蓋玻片上。兩個(gè)樣本都是用識(shí)別基質(zhì)或caspid蛋白的抗體免疫染色宫峦。作者首先將傳統(tǒng)圖像與超分辨率圖像進(jìn)行了比較回象。在TIRF圖像中罚琅，感染的t淋巴細(xì)胞中的HIV-1蛋白表現(xiàn)為明亮的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu) (圖2a)。在dSTORM中蔼邓，熒光團(tuán)的隨機(jī)激活可以分析單個(gè)蛋白質(zhì)的點(diǎn)擴(kuò)散功能 (PSF)羽矮。
dSTORM揭示了同一蛋白的分布比TIRF圖像中更大的異質(zhì)性 (圖2b)。通過dSTORM中蛋白質(zhì)簇的兩個(gè)圖像的疊加來說明使用dSTORM實(shí)現(xiàn)的分辨率的提高侨懈。
圖2 進(jìn)入淋巴細(xì)胞之前和之后感染HIV-1的單個(gè)分子的超分辨率成像
(a-c) 常規(guī)全內(nèi)反射熒光 (TIRF) 圖像 (a) 痪蚤、相應(yīng)的dSTORM圖像 (b) 和HIV-1基質(zhì)蛋白在同步進(jìn)入淋巴細(xì)胞系MT-2 20分鐘后的TIRF (白色) 和dSTORM (紅色) 圖像 (c) 的疊加。(d) dSTORM定位的分子坐標(biāo)的定位精度值的直方圖凄系，對(duì)應(yīng)于a-c中所示的數(shù)據(jù)集穴肄。定位精度對(duì)應(yīng)于擬合到單個(gè)分子的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的高斯分布的一個(gè)西格瑪，并且還受光子和噪聲水平的影響量票。虛線表示平均值人度。(e-h) 基于Ripley K函數(shù)對(duì)無細(xì)胞病毒體中的基質(zhì)蛋白進(jìn)行聚類分析，將分子坐標(biāo) (e) 的點(diǎn)分布轉(zhuǎn)換為聚類圖来讯，該聚類圖具有高度到較少的聚類區(qū)域拉氧，顏色為紅色到藍(lán)色 (f)。從閾值圖像 (g) 中提取聚類統(tǒng)計(jì)信息舶得，例如數(shù)量掰烟，大小和相關(guān)分子。通過將gfp-vpr (綠色) 的TIRF圖像與二元簇圖疊加沐批，定量了細(xì)胞進(jìn)入后病毒蛋白與逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的關(guān)聯(lián) (h)纫骑。比例尺，a-b中板為5μm; c中板為1μm九孩，e-h中板為2μm先馆。(i) 定量分析無細(xì)胞病毒粒子中衣殼蛋白分子簇的直徑，并在感染入MT-2細(xì)胞后20分鐘躺彬。誤差條表示來自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表的每個(gè)樣本26-173個(gè)簇的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差煤墙。
這種單分子成像方法使作者能夠在感染過程中跟蹤基質(zhì)殼和衣殼核心的重組，這可能反映了促進(jìn)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過程的結(jié)構(gòu)重排宪拥，例如病毒體的未包被番捂。
作者能夠通過dSTORM量化HIV-1基質(zhì)殼和衣殼核心的大小，這些結(jié)果與EM所見的已知HIV組織一致江解。此外，該方法提供了新的信息徙歼，表明當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入時(shí)废筒，與無細(xì)胞HIV-1病毒體相比，病毒體基質(zhì)殼和衣殼核心的大小顯著增加捆牍，這表明HIV顆粒在進(jìn)入靶細(xì)胞后立即經(jīng)歷了顯著的重排棉挤。
總之绳粮，這項(xiàng)研究驗(yàn)證了使用dSTORM評(píng)估傳染性病毒生命周期中病毒蛋白的分子分布，并為在早期階段研究病毒蛋白的分布和重新分布開辟了新的可能性病毒感染岳扒。
