跨膜蛋白裝配γ-分泌酶是約100種1型跨膜蛋白的受調(diào)控膜內(nèi)加工（RIP）中的關(guān)鍵蛋白酶。 重要的是，它在 阿爾茨海默病 （AD）中具有病理作用箱叁，因為它從淀粉樣前體蛋白（APP）生成神經(jīng)毒性淀粉樣β肽喧伞。因此西饵，從生物學(xué)和治療學(xué)的角度來看偏秦， γ-分泌酶的定位研究 都是至關(guān)重要的柴伪。

盡管在許多實驗室中進(jìn)行了幾年的努力，目前尚不清楚γ-分泌酶在神經(jīng)元中的何處發(fā)揮其活性诊胞。其中技術(shù)挑戰(zhàn)之一是暖夭，活性酶含有四種蛋白質(zhì)組分，并且大多數(shù)亞細(xì)胞區(qū)室不能通過傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行空間分辨撵孤。

研究介紹(節(jié)選)

γ-分泌酶是阿爾茨海默病（AD）病理學(xué)中的關(guān)鍵角色迈着，因為它催化淀粉樣前體蛋白（APP）加工的最后一步，導(dǎo)致神經(jīng)毒性淀粉樣β-肽（Aβ）的形成邪码，Aβ是AD患者大腦中淀粉樣斑塊的主要成分裕菠。γ-分泌酶產(chǎn)生長度可變的Aβ，尤其是42和43個氨基酸的變體（Aβ42和Aβ43）易于形成神經(jīng)毒性寡聚體闭专。AD患者海馬神經(jīng)元中Aβ42的細(xì)胞內(nèi)水平升高奴潘，在突觸中蓄積，并與AD病理學(xué)相關(guān)影钉。直接抑制γ-分泌酶作為AD的治療策略是復(fù)雜的画髓，因為除APP外，該酶還有大約100種不同的底物平委，包括Notch奈虾。重要的是，已證明Aβ是在突觸處產(chǎn)生的廉赔，這是在突觸前還是突觸后發(fā)生的還存在爭議以息。這種不確定性部分是由于確定突觸亞結(jié)構(gòu)所涉及的技術(shù)挑戰(zhàn)。

在這里祥怖，作者使用了兩種納米技術(shù) STORM 和 STED 顯微鏡的強大組合來可視化γ-分泌酶在神經(jīng)元中的位置兴题。作者發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶存在于 突觸前 和 突觸后區(qū)室 。研究中抽胁，作者進(jìn)一步表明該酶在 突觸后膜中 非常接近突觸間隙處富集噩檬，以及NMDA受體表明γ-分泌酶存在于突觸后質(zhì)膜。研究中权疾，作者以高精度的數(shù)據(jù)顯示了 突觸的三維位置 趋奸，并解決了長期以來關(guān)于γ-分泌酶突觸位置的爭論。

研究結(jié)果(節(jié)選)

共聚焦顯微鏡顯示满律，樹突形成了幾個突觸群鞭，軸突與樹突平行或在樹突之間延伸（圖1a），在軸突和樹突中都發(fā)現(xiàn)了γ-分泌酶咖迄，并在突觸中富集（圖1a）刃纽。PS1和nicastrin的染色顯示，這些成分與GTB在相同的區(qū)域溉浙，也在其他區(qū)域發(fā)現(xiàn)（圖1b和c）烫止。在單獨生長的軸突中蒋荚，即在很大程度上與樹突分離的軸突中，γ-分泌酶富集在前扣突結(jié)構(gòu)中（圖1d）馆蠕。這種酶也在軸突末端突觸中富集（圖1d）期升。γ-分泌酶的STED圖像，與作為軸突標(biāo)記物的Tau蛋白共同標(biāo)記互躬，進(jìn)一步證實γ-分泌酶在前結(jié)中富集播赁，并且顯示γ-分泌酶染色在前結(jié)的外部最強（圖1e）。通過STORM圖像進(jìn)一步證實了γ-分泌酶在棘上的富集吼渡，其中γ-分泌酶被GTB和Alexa 647標(biāo)記的鏈霉親和素染色（圖1f）容为。因此，三種不同的顯微鏡技術(shù)顯示γ-分泌酶在神經(jīng)元突觸處富集寺酪。

圖1 通過 dSTORM等 分析小鼠原代海馬神經(jīng)元軸突坎背、樹突和棘中γ-分泌酶的定位。

(a)MAP 2染色（藍(lán)色）寄雀、tau（綠色）和γ-分泌酶（紅色）染色的周圍軸突的放大樹突的共焦圖像得滤。如圖所示，在上部面板中顯示各個污漬百睹，而在下部面板中顯示合并圖像的不同組合房包。(b)樹突特寫中PS1和γ-分泌酶標(biāo)記的共聚焦圖像。箭頭指向PS1和γ-分泌酶共染色的突觸區(qū)域（黃色）估掐。(c)樹突特寫中PS1和nicastrin標(biāo)記的共聚焦圖像。箭頭指向突觸區(qū)盛己，同時染色的是nicastrin和γ-分泌酶（黃色）船酗。(d)共焦圖像相同的細(xì)胞的軸突與τ(a)染色在綠色上面板,γ-secretase紅色中間面板和合并后的圖像在底部面板。合并后的形象的插圖顯示了一個放大部分的MAP2(藍(lán)色)弊肢。(e)結(jié)合共聚焦顯微鏡和STED顯微鏡（γ-分泌酶收泥，中圖）觀察軸突結(jié)中活性γ-分泌酶的富集。底部面板中顯示合并圖像蠕为。(f)活性γ-分泌酶（紅色）的dSTORM圖像與明場圖像重疊琐店。注意棘上活性γ-分泌酶的富集。

γ-分泌酶在突觸處的富集使我們研究該酶是否存在于突觸前或突觸后區(qū)室中艘珊，這些區(qū)室由僅20-25nm寬的裂隙隔開俊势。這個距離比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡獲得的分辨率小10倍左右，因此STORM被用于更好地顯示突觸位置绷旗。由于我們用STORM進(jìn)行成像喜鼓，因此我們可以從不同角度研究突觸素和γ-分泌酶的分布（圖2a）。γ-分泌酶和突觸囊泡蛋白之間的接近度從各個角度都很明顯衔肢，在某些情況下庄岖，突觸囊泡蛋白和γ-分泌酶信號之間的距離小于10nm豁翎。

圖2 突觸中γ-分泌酶的STORM成像

(a)活性γ-分泌酶在突觸前區(qū)的定位顯示γ-分泌酶（紅色）和突觸前標(biāo)記突觸囊泡蛋白（藍(lán)色）。左上方的面板顯示了典型的STORM圖像隅忿，左側(cè)為明場疊加心剥，中間和右側(cè)面板放大，右側(cè)顯示了單個突觸區(qū)域背桐。下圖從三個不同角度顯示了在3D視圖中顯示的相同突觸优烧，其中紅色、綠色和藍(lán)色線分別表示X牢撼、Y和Z方向匙隔。(b)活性γ-分泌酶在突觸后區(qū)的定位，顯示γ-分泌酶（紅色）和突觸后標(biāo)記物PSD 95（藍(lán)色）熏版。左上方的面板顯示了典型的STORM圖像纷责，位于左側(cè)的明場覆蓋圖上，中間和右側(cè)面板的放大倍數(shù)增加系亭。下面板從三個不同角度顯示了3D視圖中顯示的同一突觸剿哪，其中符號中的紅色、綠色和藍(lán)色線分別表示X晋合、Y和Z方向主厅。

突觸后密度和突觸間隙之間的距離表明γ-分泌酶在突觸后質(zhì)膜中富集（圖5a-e）。STORM分析顯示NMDAR2B和γ-分泌酶之間非常接近掐腕，這為突觸后膜中存在γ-分泌酶提供了進(jìn)一步的證據(jù)（圖3）咒祠。

圖3 γ-分泌酶在突觸后質(zhì)膜的定位

(a)STED圖像顯示γ-分泌酶（紅色）非常靠近樹突棘中的突觸間隙（白色箭頭）捺再。突觸素（藍(lán)色）和PSD95（綠色）分別標(biāo)記突觸前和突觸后側(cè)萌琉。(b)γ-分泌酶（紅色）和NMDAR 2B（綠色）的STORM成像。(c)與（b）中的右圖相同的突觸后膜區(qū)域從三個不同角度顯示在3D視圖中糜隶，其中紅色咧饭、綠色和藍(lán)色線分別表示X、Y和Z方向会激。

通過以上研究結(jié)果栏渺，作者發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶主要存在于突觸前區(qū)室的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中，而在突觸后區(qū)室的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和質(zhì)膜中都有發(fā)現(xiàn)锐涯。突觸前和突觸后區(qū)室中的豐度隨著突觸的成熟而增加磕诊。作者的研究結(jié)果表明，Aβ可以在突觸前和突觸后區(qū)室產(chǎn)生纹腌。因此秀仲，本研究對于進(jìn)一步了解AD病理學(xué)具有重要意義，這與未來創(chuàng)建開發(fā)AD治療的新方法密切相關(guān)壶笼。

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