01研究背景

端粒是位于染色體末端的保護性結構涝沈，是在哺乳動物中由(TTAGGG)n和相關蛋白的混合物組成的串聯(lián)重復DNA序列浩峡。端粒在許多細胞過程中起著保護染色體免受降解割按、激活復制衰老和調節(jié)基因表達等重要作用汁展。

在體細胞中，端粒脫保護觸發(fā)DNA損傷反應和端粒介導的復制性衰老，可以被視為阻止正常老化細胞增殖的內在過程班聂。端粒也會導致干細胞的耗竭和健康細胞更新的喪失、組織再生缺陷适肠、組織功能下降霍衫、衰老細胞積累等。而衰老細胞在組織中的積聚被認為是長期慢性炎癥和與年齡相關的疾埠钛（包括癌癥）的主要原因敦跌。生物年齡是許多慢性疾病發(fā)病率的主要預測因素。在正常細胞衰老過程中逛揩，端粒完整性的喪失也會引發(fā)DNA損傷信號柠傍，最終導致衰老表型。

熒光顯微鏡有助于研究人員研究端粒的動力學息尺、形狀携兵、定位和蛋白質的共分布。研究這些結構的顯微鏡工具目前已發(fā)展到能夠對影響端粒的分子機制進行探究搂誉。作者以人類成纖維細胞為例徐紧，利用多種顯微鏡，以及兩種超分辨率技術炭懊，即三維結構照明顯微鏡(3D-SIM)和直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）來研究端粒的幾個特征并级。在本文中，重點介紹直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）對于端粒研究的益處。

02研究介紹（節(jié)選）

一迈窗、端霖菜猓可視化

深入了解維持端粒完整性所涉及的途徑和蛋白質，對于提高細胞壽命和延緩年齡相關疾病發(fā)病至關重要惑妥。大約25年前值舌，端粒DNA首次被熒光顯微鏡觀察到，只是那時候顯微技術的分辨率還有待提高示荠。大約150年前漓蜗，恩斯特·阿貝首先描述了分辨率極限，它被定義為兩個物體之間的最短距離（在這個距離上节立，它們可以被區(qū)分為兩個獨立的實體）螃恕。對于遠場熒光顯微鏡，光學分辨率由光波長和物鏡的數(shù)值孔徑決定患并。

此外膳几，細胞特征和背景之間的反差會降低圖像的分辨率，要求研究人員使用明亮的探針破溺。雖然在熒光顯微鏡中启疙，樣品中的對比度通常不是唯一因素，但分辨率在物理上受到光的衍射的限制唐片，其橫向(X丙猬，Y)分辨率為200-250納米涨颜，軸向(Z)分辨率為500-700納米费韭。為了突破衍射極限，需要在橫向庭瑰、軸向或兩者同時提高兩倍或更多的分辨率星持，目前已經開發(fā)了各種技術。

可視化弹灭、分析和定量單個端粒的首選技術之一是將端粒上發(fā)現(xiàn)的TTAGGG序列與熒光標記肽核酸(PNA)探針直接雜交督暂。這種被稱為熒光原位雜交(FISH)的技術，可以用來測定中期擴散的端粒長度穷吮，因為更多的串聯(lián)端粒序列（即更長的端粒）允許更多的PNA分子結合逻翁，因此可以看到更亮的“斑點”。為了說明FISH的應用捡鱼，作者對衰老前成纖維細胞進行中期擴散八回，并用Alexa Fluor488結合PNA探針染色端粒DNA。

圖1逛径、衰老成纖維細胞端粒熒光原位雜交撼烹、BJ成纖維細胞染色體畸變的圖像。

（A）一個有46條染色體的衰老前期BJ細胞的中期擴散，DNA用4′远燕，6-二氨基-2-苯基吲哚/DAPI（藍色）和端粒用PNA Telc-488探針（綠色）染色久泞。

（B）白色箭頭代表脆弱的端粒或端粒二重體

（C）姐妹端粒丟失導致短端粒

（D）姐妹染色單體上的無信號端

（E）間質端粒序列和姐妹端粒丟失導致一個無信號端奖放。

作者觀察了預期的46條染色體淡藻，大多數(shù)染色體末端含有可檢測到的端粒染色。將FISH應用于中期擴散對于確定染色體畸變（包括含有無信號末端的染色體）是很重要的砚粒。在這種情況下剖宪，端粒太短則不能被PNA探針識別，熒光信號太暗則不能在圖像采集期間被檢測器讀取恶恨。對無信號末端的存在雨晃，可以進行估計，可估計有多少極短的染色體或可能沒有端粒DNA痴猖。

SIM和STED可以通過控制照明光來提高分辨率躺刷，SMLM技術只記錄每張圖像中熒光團總數(shù)的稀疏子集，以實現(xiàn)20-50納米的成像分辨率狞洋。即使成像分子表現(xiàn)為衍射限制點弯淘，只要它們彼此相距至少200納米就可以通過擬合和質心查找來確定它們的準確定位。超分辨率顯微鏡和優(yōu)化的成像技術顯著提高了對端粒生物學的理解吉懊。由于端粒在間期細胞內的半徑低于衍射限制分辨率庐橙，通常為60-100納米，因此利用超分辨率技術來研究端粒的大小和形狀越來越受到人們的關注借嗽。

二态鳖、構建端粒形狀

直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）通過熒光染料的“閃爍”操作，利用單個熒光團的時間分離來工作恶导，即在任何一個時間只記錄來自稀疏的單個熒光團集的發(fā)射浆竭，再經過擬合和質心查找，將獲取的圖像序列轉換為高分辨率圖像惨寿。通常是使用Alexa Fluor647（Thermo Fisher Scientificial）邦泄，意味著單個Alexa Fluor647分子經歷了開-關（亮-暗）循環(huán)，在每次采集視場中只有約1%的熒光團發(fā)射光裂垦，利用Alexa Fluor647共軛PNA探針染色顺囊，將樣品浸入氧清除緩沖液中以促進光開關并多次循環(huán)重復，獲取時間序列后吝蔽，利用高斯擬合可以重建超分辨率圖像端辛，以此來實現(xiàn)20-30納米的橫向分辨率。

超分辨率技術dSTORM最初被用于可視化來自不同類型細胞的端粒的非環(huán)結構幌舍。早期的電子顯微鏡顯示杀蝌，端粒DNA的物理末端會折疊并置換一條DNA鏈，形成所謂的T環(huán)結構。另外的研究表明咖播，這種重要的結構在特定的防護蛋白缺失時會丟失驴嚣，導致DNA損傷反應的激活。這些研究表明铣佛，dSTORM是一種非常強大的技術黔巨，可以準確地顯示T環(huán)的結構。

作者計算袜晌、重構和可視化了dSTORM的數(shù)據预甲，在分析點云的單個大小和形狀時，發(fā)現(xiàn)端粒是極其不均勻的但惶，并不總是以球形結構出現(xiàn)耳鸯。例如，它們可能在一個維度上被拉長膀曾，形成一個更橢圓形或矩形的形狀县爬，或者非常不規(guī)則。當對BJ細胞中的單個點云進行三維可視化時添谊，作者還觀察到了各種不同的形狀财喳。當觀察到球形端粒，作者經常發(fā)現(xiàn)不規(guī)則的異構結構斩狱，這為端粒區(qū)域的性質提供線索耳高。這些圖像顯示了BJ成纖維細胞端粒DNA的不同三維排列，證實了3D-STORM是研究端粒形狀的合適技術所踊。

圖2泌枪、3D-STORM測定端粒形狀的變異性。

（A)一個二維寬視場快照的例子污筷，一個表示3D的像散寬視場快照工闺，重構3D- STORM數(shù)據的最大強度投影乍赫，以及PNA TelC-647探針染色的BJ成纖維細胞的覆蓋圖像瓣蛀。比例尺=5 μm。

（B) NEO SAFe軟件中單個本地化的可視化杭恩。每個點代表一個分子踢周，使用DBSCAN將它們分組成簇。不同的顏色代表z位置悠拗。

比例尺= 4 μm黎撤，其中紅色= x軸，綠色= y軸尘是，藍色= z軸侄灭。識別出各種不同的形狀，包括球形(C)、不規(guī)則(D)和橋狀結構(E)亏傅。標尺桿= 50 nm摊谢，其中紅色= x軸，綠色= y軸醉装，藍色= z軸辕芳。

三、測量端粒大小

由于3D-STORM的橫向分辨率為20-30納米宵睦，軸向分辨率為50-70納米记罚，因此可以用來測量端粒大小。根據SMLM成像壳嚎，端粒大小的一個常見讀數(shù)是回轉半徑桐智，即每個單個分子到分子云質心位置（質心）的均方根距離。然而烟馅，由分子云的最外層點確定的端粒體積也可以作為尺寸的讀出值酵使。利用這些測量，研究小組試圖計算端粒密度或壓實焙糟，它代表一定體積內端粒DNA的數(shù)量口渔，以探索端粒DNA是如何包裝的。然而穿撮，Alexa Fluor647的光開關特性使得在dSTORM采集過程中缺脉，一個Alexa Fluor647分子可以被多次檢測。因此悦穿，雖然短端粒平均來說比長端粒有更少的開關周期攻礼，長端粒含有更多的PNA探針，但一個定位并不等于一個Alexa Fluor647分子落怀。這使得很難根據定位的數(shù)量和大小來提取密度測量值甚宜。一種可能是根據每個端粒焦點的定位數(shù)量來繪制體積，放松會導致更垂直的繪制線路百览。然而映情，如果PNA探針雜交受到端粒致密狀態(tài)的影響，其密度可能被低估笑杯。另一個需要注意的特點是3D-STORM有一個有限的Z深度阱墩，通常在800-1000納米左右。因此辱得，為了覆蓋整個核局该，需要在多個焦平面上進行三維STORM成像，并進行折射率校正沉享。盡管勞動強度很大涉佑，這項技術揭示了線粒體和微管之間的新的相互作用加梁，并可能對端粒與核膜的相互作用提供更多的見解。它對于T環(huán)的可視化和單個短端粒的尺寸測量非常強大淮超，超出了3D-SIM所能實現(xiàn)的范圍踢故。

圖3、通過不同的方法惹苗，將端粒的大小與寬視場殿较、3D-SIM和dSTORM顯微鏡技術所能分辨的最小體積進行比較。

03超高分辨顯微成像系統(tǒng)iSTORM

傳統(tǒng)的顯微鏡技術使了解端粒生物學基礎成為可能桩蓉，但端粒的納米級研究還確實需要隨機光學重建顯微鏡STORM等超分辨率顯微鏡淋纲。目前，在國內院究，隨機光學重建顯微鏡STORM已成功實現(xiàn)商用∏⑺玻現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM，成功實現(xiàn)了光學顯微鏡對衍射極限的突破业汰，使得在 20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數(shù)伙窃、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現(xiàn)實样漆，從而給生命科學为障、醫(yī)學等領域帶來重大突破 。

超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 納米超高分辨率放祟、3通道同時成像鳍怨、3D同步拍攝、實時重構巾妖、2小時新手掌握 等特點估横，并提供熒光染料選擇、樣本制備牵梗、成像服務與實驗方案整體解決方案台筷， 以納米級觀測精度、高穩(wěn)定性仓脓、廣泛環(huán)境適用售微、快速成像、簡易操作等優(yōu)異特性凸窖，獲得高度認可望星！

參考文獻

Adam N, Beattie TL, Riabowol K. Fluorescence microscopy methods for examining telomeres during cell aging. Ageing Res Rev. 2021 Jul;68:101320. doi: 10.1016/j.arr.2021.101320. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33744488.