“ RNA polymeraseII（RNAPII）負(fù)責(zé)大多數(shù)真核生物蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄。分析RNAPII的拓?fù)浞植己投坑兄诶斫馄湓诩?xì)胞間期的功能。以前的研究表明，RNAPII分子在分化的擬南芥核的異染色質(zhì)中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而不是像在哺乳動(dòng)物核中觀察到的那樣組織在不同的 "轉(zhuǎn)錄工廠 "中眨额。 ”

通過結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡（SIM）獲得的圖像堆棧的最大強(qiáng)度投影中基于特定抗體標(biāo)記的免疫信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量表明內(nèi)多倍體植物核中RNAPII的相對(duì)比例增加。本研究中應(yīng)用光活化定位顯微鏡（PALM）來確定分化的擬南芥核中活性和非活性RNAPII分子的絕對(duì)數(shù)量和分布。在內(nèi)多倍體化過程中RNAPII的比例增加得到證實(shí)杆煞，同時(shí)也證明了PALM的測(cè)量在定量方面比基于SIM的測(cè)量更可靠。單分子定位結(jié)果表明腐泻，雖然RNAPII分子在植物常染色質(zhì)內(nèi)全局分散决乎，但它們也像哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄工廠所描述的那樣在較小的距離內(nèi)聚集。

《Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei》

01研究結(jié)果（節(jié)選）

1派桩、結(jié)合SIM和PALM對(duì)擬南芥核中RNAPII進(jìn)行超分辨率成像

大多數(shù)真核基因由RNAPII轉(zhuǎn)錄构诚，細(xì)胞核中活性RNAPII的數(shù)量反映了轉(zhuǎn)錄的程度蚌斩。電子和光學(xué)顯微鏡證明了轉(zhuǎn)錄本和RNAPII的共定位。根據(jù)其在基因上的位置和轉(zhuǎn)錄階段范嘱，RNAPII被不同程度地磷酸化送膳，而無活性的RNAPII主要是未磷酸化的。在哺乳動(dòng)物中斤间，RNAPII被認(rèn)為是組織在不同的所謂 "轉(zhuǎn)錄工廠 "中穆烹，研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄工廠的直徑和其中RNAPII分子的個(gè)數(shù)的高變異性不僅是由分析的不同細(xì)胞類型引起的稿棚，而且是由應(yīng)用的不同成像方法引起的极求，而超分辨率顯微成像技術(shù)，如結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡（SIM）和光活化定位顯微鏡（PALM）种鳖，以超出光的衍射極限的高精度定位單個(gè)分子惹你，可以更可靠地計(jì)數(shù)細(xì)胞中的分子。

細(xì)胞核被標(biāo)記針對(duì)活性和非活性RNAPII的特異性抗體哈滥，結(jié)合應(yīng)用SIM與3D-PALM糊扑。在SIM圖像中確定RNAPII酶的分布后，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得可見喷总。通過3D-PALM以記錄單個(gè)閃爍分子的數(shù)量和定位樟闽。當(dāng)分子被渲染到獲得的定位精度時(shí)，除了缺乏RNAPII的核仁柳卒，活性和非活性 RNAPII分子均勻分布在整個(gè)細(xì)胞核中笨扁。SIM與PALM的組合以及不同RNAPII分子與同一細(xì)胞核中熒光團(tuán) Alexa488 和 Cy5 的同時(shí)標(biāo)記允許單個(gè)分子定位在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。沒有出現(xiàn)活性和非活性RNAPII的共定位列疗，表明這兩種分子在常染色質(zhì)內(nèi)占據(jù)不同的區(qū)域滑蚯。

圖1. 擬南芥葉核中RNAPII分子的分布

2、使用3D-PALM對(duì)RNAPII分子分布情況進(jìn)行分析

超分辨率顯微鏡還可以評(píng)估生物標(biāo)本的第三維抵栈，本研究中首次通過應(yīng)用3D-PALM確定了分化的內(nèi)多倍體植物細(xì)胞核中RNAPII分子的數(shù)量告材。由于存在更多分子，活性RNAPII顯示出比非活性更高的全局密度古劲。這兩種RNAPII都表現(xiàn)出相似的聚集行為斥赋，并且規(guī)律出現(xiàn)高積累位點(diǎn)。對(duì)于活性和非活性RNAPII产艾，小簇內(nèi)單個(gè)RNAPII分子之間的距離在20nm和40nm之間疤剑。對(duì)于活性和非活性RNAPII，存在小簇之間進(jìn)一步積累的區(qū)域闷堡。因此隘膘，除了常染色質(zhì)內(nèi)兩種RNAPII分子的全局分散外，RNAPII分子也可能在兩個(gè)不同的水平上聚集。盡管平均單分子距離為27nm棘幸，但活性RNAPII分子比非活性分子更密集地聚集在小距離和大距離簇中。大小簇對(duì)應(yīng)于已知的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄工廠的大小妨舟。

圖2. 由3D-PALM記錄的8C擬南芥核中非活性和活性RNAPII分子的分布

圖3. 活性RNAPII（Ser2ph）的分布和聚集情況

3问乌、RNAPII分子的數(shù)量與內(nèi)多倍體的關(guān)系

研究者利用3D-PALM還估計(jì)了整個(gè)細(xì)胞核內(nèi)活性和非活性RNAPII的拷貝數(shù)。在分化的2C和內(nèi)多倍體4C-16C葉核中邦叶，活性RNAPII（Ser2ph）的平均數(shù)量增加寂齐，范圍在2C中的~13000和16C中的~58000之間。然而尺笼，在核內(nèi)復(fù)制過程中精確酶復(fù)制的情況下肃逐，分子數(shù)量并未如理論上所預(yù)期的那樣按比例增加。

圖4. 2C–16C核中活性RNAPII（Ser2ph）的平均數(shù)

4林下、一種內(nèi)多倍體植物間期細(xì)胞核的組織模型

先前的研究結(jié)果表明袄肩，染色體結(jié)構(gòu)維持凝聚蛋白（SMC）和凝聚蛋白復(fù)合亞基SMC3和CAP-D3，分別在分化的內(nèi)多倍體擬南芥核常染色質(zhì)內(nèi)顯示出類似于 RNAPII的網(wǎng)狀分布腋芜≡俑保基于此，研究者提出了一個(gè)模型（圖5）：兩個(gè)不同的相鄰染色體臂區(qū)域（藍(lán)色和白色）花炭，異染色質(zhì)高度濃縮躬拢。姐妹染色單體的常染色質(zhì)由約50kb的染色質(zhì)片段組成，這些片段進(jìn)一步聚集见间。姐妹染色單體片段可以是內(nèi)聚的或分開的聊闯。染色質(zhì)纖維可能發(fā)源于RNAPII分子聚集的地方，并在潛在的轉(zhuǎn)錄工廠中被激活米诉。無活性的RNAPII分子菱蔬，大部分也聚集分布在常染色質(zhì)內(nèi)。SMC3和CAP-D3亞基均勻分布史侣，可能負(fù)責(zé)維持靈活的常染色質(zhì)組織汗销。

圖5. RNAPII和SMC蛋白復(fù)合物亞基（SMC3和CAP-D3）在間期植物核常染色質(zhì)內(nèi)的排列模型

02研究總結(jié)

1.由不同的RNAPII形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包含一些主要全局分散的單分子抵窒，它們可能聚集成已知的動(dòng)物“轉(zhuǎn)錄工廠”的尺寸弛针；

2.通過3D-PALM定量RNAPII比SIM圖像堆棧生成的最大強(qiáng)度投影的信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量更可靠；

3.3D-PALM測(cè)量證實(shí)RNAPII分子的數(shù)量隨著內(nèi)多倍體的程度增加李皇。

參考文獻(xiàn)

References

1.Schubert, Veit, and Klaus Weisshart. "Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei." Journal of experimental botany 66.6 (2015): 1687-1698.

在本研究中削茁，研究者主要借助3D-PALM超分辨率顯微鏡來研究RNAPII，3D-PALM與3D-STORM原理相似掉房，目前在國(guó)內(nèi)茧跋，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM已成功實(shí)現(xiàn)商用，有需要STORM成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的專家老師們，請(qǐng)文末填寫問卷捉肄，即可預(yù)約獲得 iSTORM 超高分辨率顯微成像系統(tǒng)試拍服務(wù)~

力顯智能現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM乃屈，成功實(shí)現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對(duì)衍射極限的突破，使得在20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計(jì)數(shù)常苍、亞細(xì)胞及大分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析兼英、生物大分子生物動(dòng)力學(xué)等的研究成為現(xiàn)實(shí)，從而給生命科學(xué)鸵丸、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來重大突破喳牌。

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