“ 神經(jīng)科學(xué)的進(jìn)步與細(xì)胞成像的進(jìn)展密切相關(guān)。17 世紀(jì)顯微鏡的發(fā)明首次允許在細(xì)胞水平上對人腦進(jìn)行表征，并在 18 和 19 世紀(jì)出現(xiàn)了臨床神經(jīng)病學(xué)、神經(jīng)外科和精神病學(xué)。同樣，對神經(jīng)退行性疾病的理解和分類也得益于 20 世紀(jì)下半葉免疫染色技術(shù)和多通道熒光成像的發(fā)展。然而，盡管取得了這些進(jìn)展，衍射屏障仍然是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率限制，阻礙了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精確表征。在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡中，所有被照射的分子在衍射極限體積內(nèi)同時(shí)發(fā)出信號，從而限制了最終獲取圖像的空間分辨率。 ”

近些年，超分辨率顯微鏡技術(shù)克服了這一障礙，使用不同的方法來區(qū)分位于同一衍射極限體積內(nèi)的熒光分子。其中之一稱為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡 (STORM)，它基于單分子定位，通過在不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)打開衍射受限體積內(nèi)的光開關(guān)熒光分子，因此它們的信號基本上不會重疊。當(dāng)在空間中隔離時(shí)，可以通過定位其信號的中心位置來確定每個(gè)單獨(dú)熒光團(tuán)的位置。然后從隨時(shí)間累積的眾多分子定位生成超分辨率圖像，提供 < 50 nm 的空間分辨率。

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，這項(xiàng)新技術(shù)導(dǎo)致了神經(jīng)元軸突細(xì)胞骨架周期性結(jié)構(gòu)的表征和突觸蛋白的空間組織。在這項(xiàng)研究中，研究者將用細(xì)胞成像技術(shù)與神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對來自對照受試者和常見年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病患者的人腦樣本進(jìn)行 2D、3D 和雙色 STORM。

《STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain》

NO.1研究結(jié)果（節(jié)選）

1、使用 STORM 對人腦樣本進(jìn)行超分辨率成像

為了評估人腦組織的 STORM 成像，我們首先旨在解析明確其組織學(xué)結(jié)構(gòu)，例如新皮質(zhì)軸突束。來自對照受試者的前額葉皮層的冷凍樣本通過標(biāo)準(zhǔn)的低溫恒溫器方法切割， 并用抗神經(jīng)絲一抗和與 Alexa Fluor (AF) 647 偶聯(lián)的二抗進(jìn)行免疫染色。對帶有免疫染色腦切片的蓋玻片放置在配備高功率激光模塊、全內(nèi)反射熒光 (TIRF) 系統(tǒng)和電子倍增電荷耦合器件 (EMCCD) 單光子敏感的倒置電動(dòng)顯微鏡的載物臺上（圖1A )。

圖1. 使用 STORM 對人腦樣本進(jìn)行超分辨率成像

STORM 在人腦切片中對神經(jīng)絲 (NF) 免疫染色的皮層軸突的采集：首先獲得傳統(tǒng)的寬視場熒光顯微鏡圖像 (B1)，然后強(qiáng)烈增加激發(fā)功率以誘導(dǎo)熒光團(tuán)閃爍，并產(chǎn)生數(shù)千幀圖片（B2-B5）。在每幀基礎(chǔ)上以亞像素精度 (B6-B9) 檢測激活的熒光分子的定位。然后使用來自所有幀的累積定位來重建超分辨率圖像（B10）。

2、人腦樣本的 3D-STORM 和雙色 STORM 成像

三維 (3D) 和多通道成像提供了對納米級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組織的深入了解成為了可能。為了在人腦切片中執(zhí)行 3D-STORM，研究者使用了一種基于散光的方法 。在顯微鏡的檢測路徑中設(shè)置柱面透鏡后，從其圖像的橢圓度確定每個(gè)熒光分子的z坐標(biāo)。對照受試者的前額葉皮質(zhì)樣本對神經(jīng)絲 (NF) 進(jìn)行免疫染色，重建后，軸突以高分辨率和約 0.5 μm 的成像深度在 3D 中可視化（圖2A)。軸突束的圓柱形狀是可辨別的，并且 3D 建模軸突的縱向和橫向截面的尺寸與 2D-STORM 獲得的尺寸相似。

然后，為了評估皮層樣本的雙色 STORM 成像，研究者使用兩種檢測附近結(jié)構(gòu)的一抗（突觸前和突觸后巴松管和荷馬 1 蛋白）以及與光開關(guān)熒光團(tuán) AF 647 和 AF 532 偶聯(lián)的二抗對人腦切片進(jìn)行免疫染色（圖2B)。在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡下，巴松管和荷馬 1 信號出現(xiàn)彌散和重疊，突觸間隙無法精確定義。相比之下，雙色 STORM 準(zhǔn)確區(qū)分了由突觸間隙分隔的突觸前和突觸后蛋白簇，并定義了突觸的大小、方向和組織。有趣的是，也可以實(shí)現(xiàn)將傳統(tǒng)的寬視場熒光顯微鏡和 STORM 相結(jié)合的多通道成像，允許使用光可切換和非光可切換熒光團(tuán)對大腦結(jié)構(gòu)進(jìn)行超分辨率成像。盡管不如雙色 STORM 特異性，但該技術(shù)提供了有關(guān)相鄰結(jié)構(gòu)布局的有價(jià)值信息，例如軸突束周圍的髓鞘（圖 2C)。超分辨結(jié)構(gòu)的尺寸與在相同區(qū)域使用 TEM 測量的尺寸相當(dāng)（圖2B3,C3）。

圖2.人腦生理結(jié)構(gòu)的 3D-STORM 和雙色 STORM 圖像

3、淀粉樣蛋白-Β 和 TAU 蛋白病的 STORM 成像

阿爾茨海默病 (AD) 是癡呆癥的主要原因。該疾病的兩個(gè)主要標(biāo)志是 Aβ 肽的細(xì)胞外沉積物，其中一些構(gòu)成了老年斑的核心，以及稱為神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFT) 的過度磷酸化 tau 蛋白 (p.Tau) 的神經(jīng)元內(nèi)聚集體。由于聚集體的尺寸可達(dá) 100 μm，因此保持整個(gè)病變的整體視圖對于研究大腦中的 Aβ 和 Tau 病理學(xué)至關(guān)重要，而高分辨率成像對于表征錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的納米級組織是必不可少的。

研究者使用 STORM 對整個(gè)老年斑和退化神經(jīng)元進(jìn)行了成像。來自 AD 患者的前額葉、頂葉和顳葉皮層的組織樣本針對 Aβ 和 p.Tau（磷酸 Ser202、Thr205）進(jìn)行了免疫染色。獲得了~30 μm 直徑的老年斑和~15 μm 具有 NFT 的退化神經(jīng)元的 STORM 圖像。雖然 Aβ 原纖維和 Tau 的成對螺旋絲不能像 TEM 一樣被識別，但 STORM 圖像提供了 Aβ 和 p.Tau 聚集體的納米級分布和尺寸的高分辨率細(xì)節(jié)（圖 3 )。神經(jīng)元內(nèi) p.Tau NFT 看起來更密集，胞體中具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)，軸突中具有絲狀組織。聚集體中未染色點(diǎn)的存在表明包含其他成分，如蛋白質(zhì)或細(xì)胞器。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào) STORM 可用于以高分辨率對 AD 患者腦樣本中的 Aβ 和 p.Tau 聚集體進(jìn)行成像。

圖3.人腦生理結(jié)構(gòu)的 3D-STORM 和雙色 STORM 圖像

4、路易斯病理學(xué)的 STORM 成像

帕金森病 (PD) 和路易體癡呆 (DLB) 是兩種神經(jīng)退行性疾病，其特征是存在神經(jīng)元內(nèi)磷酸化的 α-突觸核蛋白 (p.α-syn) 免疫反應(yīng)性包涵體，稱為路易體 (LB) 。LB 的結(jié)構(gòu)根據(jù)它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的定位而變化。通過免疫組織化學(xué)可以觀察到兩種主要的 LB 類型：典型的路易小體 (TLB)，其核心蒼白，周圍環(huán)繞著主要在腦干中的致密暈圈，以及較小的皮質(zhì)路易小體 (CLB)，缺乏中央核心，主要在新皮質(zhì)中檢測到. 也可以觀察到 p.α-syn 在稱為路易軸突 (LN) 的營養(yǎng)不良軸突中的積累。迄今為止，LB 的結(jié)構(gòu)仍不清楚，因?yàn)閭鹘y(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率太低，無法表征其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并且 TEM 無法提供有關(guān)其蛋白質(zhì)含量和組織的足夠信息。

為了使用分子染色方法在納米級表征 LB 組織，研究者對來自 PD 和 DLB 患者的腦樣本進(jìn)行了 STORM 成像。用抗 p.α-syn（磷酸化 Ser129）抗體對黑質(zhì)和前額葉皮層切片進(jìn)行免疫染色，并獲得 TLB、CLB 和 LN 的圖像。盡管只有 STORM 圖像精確定義了它們的結(jié)構(gòu)，但在常規(guī)和超分辨率成像中均觀察到 TLB 的環(huán)形外觀（圖4A）。蒼白的核心看起來沒有染色，而外圍的致密暈是由網(wǎng)狀 p.α-syn 構(gòu)成的。同樣，CLB 的 STORM 成像揭示了傳統(tǒng)熒光顯微鏡無法觀察到的致密蜂窩結(jié)構(gòu)（圖 4B,4C）。至于 p.Tau 聚集體，在 LB 中觀察到的未染色核心和斑點(diǎn)可能對應(yīng)于蛋白質(zhì)伙伴或被困細(xì)胞器。

圖4. PD 和 DLB 患者腦樣本中路易體的 STORM 圖像

事實(shí)上，路易體是由 100 多種蛋白質(zhì)組成的多蛋白復(fù)合物，包括 p.Tau 。因此，我們使用針對 p.Tau 和 p.α-syn 的抗體對 LB 進(jìn)行了雙色 STORM像，以精確定義病變的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并明確區(qū)分一種蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)（圖 5A）。STORM 成像準(zhǔn)確測量了聚集 p.α-syn 分支的寬度和在 CLB 中觀察到的未染色核心面積（圖 5B）。最后，LN 的雙色 STORM 成像揭示了神經(jīng)突的內(nèi)部組織，其中包含與神經(jīng)絲結(jié)合的聚集 p.α-syn 核心（圖 5C )。這些 p.α-syn 聚集體的第一批 STORM 圖像為表征人類大腦中路易病理學(xué)的組成和空間組織提供了廣闊的前景。

圖5. 路易體和路易神經(jīng)突的共定位和超微結(jié)構(gòu)分析

NO.2研究總結(jié)

在這項(xiàng)工作中，研究者結(jié)合超分辨率顯微鏡和神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)來分析人腦切片。該策略以 <50 nm 分辨率表征生理結(jié)構(gòu)（如軸突和突觸）的結(jié)構(gòu)，并以前所未有的細(xì)節(jié)對來自神經(jīng)退行性疾病患者的樣本中的 Aβ、Tau、α-突觸核蛋白和 TDP-43 病理聚集體進(jìn)行成像。

迄今為止，組織中納米結(jié)構(gòu)成像的主要方法依賴于透射電子顯微鏡，這是一種耗時(shí)的技術(shù)，需要具有嚴(yán)格樣品制備的超薄組織切片（50-70 nm），并限制免疫靶向多樣性和 3D 采集。相反，STORM 在樣品制備、廣闊的觀察視野、多分子標(biāo)記和 3D 采集方面提供了光學(xué)熒光顯微鏡的優(yōu)勢，圖像采集和重建只需幾分鐘。在這項(xiàng)工作中開發(fā)的用于人腦組織觀察的樣品制備工作流程既省時(shí)又易于重現(xiàn)。

雙色STORM允許突觸的分子結(jié)構(gòu)的可視化，精確地識別前和突觸后蛋白簇和限定它們的尺寸，形態(tài)和取向。STORM 還用于對阿爾茨海默病小鼠模型中的病理性 Aβ 聚集體進(jìn)行成像，其結(jié)果與我們在人類中的結(jié)果相當(dāng)，無論是斑塊形態(tài)還是 Aβ 原纖維寬度，范圍從 50 到 300 nm最后，帕金森病小鼠模型中 α-突觸核蛋白聚集體的 STORM 成像允許可視化多巴胺能神經(jīng)元中的 α-突觸核蛋白聚集。

通過揭示以前沒有被可視化的新結(jié)構(gòu)和特征，固定人體組織樣本的 STORM 成像為更全面地了解人類大腦組織和揭示常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在機(jī)制打開了進(jìn)一步的大門。這項(xiàng)技術(shù)的便利性應(yīng)該為 STORM 應(yīng)用程序的直接擴(kuò)展開辟了人類大腦樣本的超分辨率成像，為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)的挑戰(zhàn)提供了有希望的新途徑。

參考文獻(xiàn)References

1. Codron, P., F. Letournel, S. Marty, L. Renaud, A. Bodin, M. Duchesne, C. Verny, G. Lenaers, C. Duyckaerts, J. P. Julien, J. Cassereau, and A. Chevrollier. 2021. 'STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain', Neuropathology and applied neurobiology, 47: 127-42.

力顯智能現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM，成功實(shí)現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對衍射極限的突破，使得在20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計(jì)數(shù)、亞細(xì)胞及大分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析、生物大分子生物動(dòng)力學(xué)等的研究成為現(xiàn)實(shí)，從而給生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來重大突破。