隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，簡(jiǎn)稱STORM)盈厘，是一種超分辨率顯微鏡逼庞，其分辨率比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上当盘。

我們知道你辣，光學(xué)顯微鏡憑借其非接觸立轧、無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。但由于光的衍射限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率钓猬，傳統(tǒng)的顯微鏡已經(jīng)不適于生命科學(xué)研究中的超微結(jié)構(gòu)成像了稍刀。本文將從原理、應(yīng)用等方面對(duì)隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM進(jìn)行相關(guān)研究草悦，若表述不正確或者不到位赔绒，請(qǐng)各位老師指正。

01光的衍射限制了光學(xué)顯微鏡的分辨率

在了解STORM之前蝠兽，需要先知悉一個(gè)概念衡孽。眾所周知，光學(xué)顯微鏡是用可見光來(lái)觀察生物樣品的警综。而光是一種橫波谨寂，當(dāng)它經(jīng)過(guò)一個(gè)圓孔，且這個(gè)圓孔的大小與光的波長(zhǎng)差別不大時(shí)呵寂，光在此時(shí)不會(huì)沿直線傳播脆携，而是在各個(gè)方向上“溜走”。 光在傳播過(guò)程中豌魏，遇到障礙物或小孔時(shí)瞭核，光將偏離直線傳播的路徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑サ默F(xiàn)象，這就叫 光的衍射 唉私。

由此而形成的圓孔衍射圖樣绎蒙，叫“艾里斑”（圖1）。正因如此匪傍，任何一種顯微鏡系統(tǒng)都無(wú)法把光線在像平面匯聚成無(wú)限小的點(diǎn)您市，而是只能形成有限大小的艾里斑。如果兩個(gè)點(diǎn)很接近役衡，像平面上的兩個(gè)艾里斑就幾乎重合在一起茵休，那物平面上的兩個(gè)點(diǎn)就不可分辨了。

圖1手蝎、“艾里斑”概念圖

所以榕莺，光的衍射使得光學(xué)顯微鏡的分辨率存在著極限(約為200 nm)，使得傳統(tǒng)顯微鏡無(wú)法清晰觀察尺寸在200 nm以內(nèi)的生物結(jié)構(gòu),極大制約了生命科學(xué)研究的發(fā)展棵介。

02超分辨率顯微鏡打破分辨率極限

科研工作者為了看到更精細(xì)的生命體精細(xì)結(jié)構(gòu)钉鸯，就要想辦法突破這一成像障礙。為此邮辽，多種超分辨率顯微鏡被開發(fā)了出來(lái)（超越了光學(xué)顯微鏡的分辨率極限唠雕，故被稱為超分辨顯微鏡）。 在這里吨述，我們集中討論其中這樣一個(gè)具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的顯微鏡： 隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM 岩睁。

在2006年的Nature上钞脂，莊小威與其它同事發(fā)現(xiàn)了一種能夠數(shù)百次反復(fù)在各種顏色的光照下使用且可在熒光態(tài)和暗態(tài)轉(zhuǎn)化的發(fā)光分子團(tuán)，從而得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)湖生，并將其命名為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡狡煎，簡(jiǎn)稱STORM。

03隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM技術(shù)原理簡(jiǎn)介

正如前面提到的那樣澳敞，兩個(gè)挨得很近的光點(diǎn)會(huì)讓我們分辨不出誰(shuí)是誰(shuí)瞧纹，那么如果我們分開來(lái)看呢？

也就是說(shuō)宴宠，當(dāng)我們照射并觀察第一個(gè)點(diǎn)時(shí)澳券，第二個(gè)點(diǎn)并不會(huì)發(fā)光，自然不會(huì)產(chǎn)生艾里斑影響我們觀察第一個(gè)點(diǎn)仲蔼，前者艾里斑的中心點(diǎn)位置就是熒光分子的準(zhǔn)確位置晾充。 接下來(lái)，通過(guò)某種方法些搅，讓第二個(gè)點(diǎn)被照亮。這個(gè)時(shí)候第一個(gè)點(diǎn)又不在光斑的照明范圍之內(nèi)了赛邢，同樣不會(huì)干擾對(duì)第二個(gè)點(diǎn)的觀察乏呐。通過(guò)這種“以時(shí)間換空間”的設(shè)計(jì)，巧妙地繞開了阿貝極限（顯微鏡分辨極限）的束縛剥悟，將光學(xué)顯微鏡的分辨率大大提高灵寺。

STORM技術(shù)就運(yùn)用了這種思想，它使用的是有機(jī)熒光分子對(duì)染料区岗，并且通過(guò)一些方法使細(xì)胞內(nèi)的一小部分熒光分子發(fā)光略板，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點(diǎn)分布比較分散慈缔，重疊比較少叮称，因此每個(gè)光暈可以近似為一個(gè)熒光分子。在一次激發(fā)中藐鹤，可以確定一部分光暈的中心瓤檐，在下一次激發(fā)中，可以確定另外一部分光暈的中心娱节，把這許多次激發(fā)的結(jié)果疊加挠蛉，就是完整而清晰的圖像。

STROM成像過(guò)程包含一系列圖像循環(huán)肄满。每個(gè)循環(huán)中谴古，只打開視野下一部分熒光基團(tuán)，這樣每個(gè)活躍的熒光集團(tuán)都被分辨拭兢，它們的圖像與其他分子分開少镇，不重疊胯炊。這樣確定了基團(tuán)的準(zhǔn)確位置，多次重復(fù)這個(gè)過(guò)程嫉簿，每次隨機(jī)打開熒光基團(tuán)的不同亞基抬而，得到圖像，確定每個(gè)亞基的位置后封鹦，把以上圖像重建成清晰的整個(gè)圖像墓老。 理論上STORM可得到分辨率達(dá)到幾個(gè)納米的熒光圖像。

04隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡STORM技術(shù)應(yīng)用案例

隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)是一種超分辨率顯微技術(shù)晾游，能夠在二維或三維辽蚀、多種顏色下成像，甚至可以對(duì)活細(xì)胞成像丽信。這種成像技術(shù)的方法根據(jù)正在成像的內(nèi)容泳落、如何成像以及正在產(chǎn)生的圖像類型而變化很大，可以應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域物忠，并為從神經(jīng)科學(xué)到亞細(xì)胞科學(xué)的許多不同需求提供非常高分辨率的圖像婚被。自STORM技術(shù)被提起以來(lái)，越來(lái)越多的研究人員認(rèn)識(shí)到了這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)并廣泛運(yùn)用于研究中梳虽。

（以近些年的部分研究成果為例）

2013年址芯，cell 雜志上的一篇研究報(bào)告：莊小威團(tuán)隊(duì)利用超分辨率熒光成像方法（STORM）對(duì)端粒 DNA 進(jìn)行原位成像，直接可視化染色質(zhì)中的 T 環(huán)結(jié)構(gòu)窜觉，并系統(tǒng)地評(píng)估保護(hù)蛋白在 T 環(huán)形成中的作用谷炸。

圖3、STORM 成像顯示染色質(zhì)擴(kuò)散后的 T 環(huán)

2017年禀挫，Liu Riyue團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種光漂白的方法旬陡，以有效地降低藍(lán)藻和植物細(xì)胞的自身熒光并利用STORM技術(shù)在球形藍(lán)藻原綠球菌和開花植物擬南芥中獲得了~10nm的橫向分辨率。

圖4语婴、雙Z環(huán)的STORM圖像

2018年描孟，Lin, Danying團(tuán)隊(duì)提出了一種在固定樣本上采用Refresh熒光探針的方法，擴(kuò)展了多層 3D STORM的成像深度腻格，并顯示了COS-7 細(xì)胞中微管画拾、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道、擴(kuò)展深度 3D prSTORM圖像菜职。

圖5摊矮、 COS-7 細(xì)胞中微管、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三通道睬漩、擴(kuò)展深度 3D prSTORM 圖像

2019影偶，Schlegel J , Peters S , Doose S 團(tuán)隊(duì)通過(guò)直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）進(jìn)行超分辨率顯微鏡觀察，顯示腦膜炎球菌周圍有GM1聚集漫诬，突出了其對(duì)細(xì)菌侵襲的重要意義确羹。

圖6届审、表達(dá)GFP的腦膜炎球菌（綠色）的GM1和Gb3的dSTORM圖像

2021，Hazime, K.S., Zhou, Z., Joachimiak團(tuán)隊(duì)運(yùn)用STORM技術(shù)發(fā)現(xiàn)癣偶，表達(dá)IFT融合蛋白的細(xì)胞在纖毛基部噪旭，IFT亞基位于九個(gè)不同的位點(diǎn)，在它們進(jìn)入纖毛干之前恃楔，IFT蛋白以高親和力凸该铮靠在纖毛基部的9個(gè)位點(diǎn)。

圖7涡写、IFT顆粒蛋白的定位菩擦，N-或C-末端3HA標(biāo)記的IFT蛋白、KIN1/KIF3A驅(qū)動(dòng)蛋白和銜接蛋白ODA16的頂視圖和側(cè)（側(cè)）視圖的STORM圖像搅窿。

2021嘁酿，Blandin, Anne-Florence團(tuán)隊(duì)利用球狀體膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散的體外模型，發(fā)現(xiàn)α5整合素缺失的細(xì)胞比表達(dá)α5的細(xì)胞對(duì)TKIs更敏感男应。

圖8闹司、吉非替尼處理的細(xì)胞的雙色dSTORM圖像顯示細(xì)胞外周和核內(nèi)體上的EGFR/β1整合素復(fù)合體

STORM因?yàn)槠鋬?yōu)異的單分子成像能力，越來(lái)越多的被用在細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的探索沐飘。對(duì)STORM的更多研究將提供更有效的方法來(lái)制備樣品和成像樣品开仰，以及提供更高分辨率的圖像。相信在未來(lái)這項(xiàng)技術(shù)能得到進(jìn)一步發(fā)展薪铜，變成功能更為強(qiáng)大的利器。

05超高分辨顯微成像系統(tǒng)iSTORM

現(xiàn)已發(fā)布的超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM恩溅，成功實(shí)現(xiàn)了光學(xué)顯微鏡對(duì)衍射極限的突破隔箍，使得在 20 nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計(jì)數(shù)、亞細(xì)胞及超分子結(jié)構(gòu)解析脚乡、生物大分子生物動(dòng)力學(xué)等的研究成為現(xiàn)實(shí)蜒滩，從而給生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來(lái)重大突破 奶稠。

超高分辨率顯微成像系統(tǒng) iSTORM 具有 20 nm超高分辨率绍掂、3通道同時(shí)成像、3D同步拍攝钟唯、實(shí)時(shí)重構(gòu)识俄、2小時(shí)新手掌握 等特點(diǎn)，已實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞單分子定位與計(jì)數(shù)焚痰，并提供熒光染料選擇纫蝗、樣本制備、成像服務(wù)與實(shí)驗(yàn)方案整體解決方案盯萄， 以納米級(jí)觀測(cè)精度仇韩、高穩(wěn)定性睁衰、廣泛環(huán)境適用、快速成像塌纯、簡(jiǎn)易操作等優(yōu)異特性蝴趾，獲得了高度認(rèn)可。

參考文獻(xiàn)：

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